1 гд: 1 ГД-28 | ldsound.ru — Только эффективные знания в удобной для вас форме. Практика и никакой воды.

Содержание

Постановление ГД ФС РФ от 19.04.1995 N 713-1 ГД

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ДУМА ФЕДЕРАЛЬНОГО СОБРАНИЯ
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПОСТАНОВЛЕНИЕ
от 19 апреля 1995 г. N 713-1 ГД

ОБ ОБЪЯВЛЕНИИ АМНИСТИИ В СВЯЗИ С 50-ЛЕТИЕМ ПОБЕДЫ
В ВЕЛИКОЙ ОТЕЧЕСТВЕННОЙ ВОЙНЕ 1941 — 1945 ГОДОВ

В ознаменование 50-летия Победы в Великой Отечественной войне 1941 — 1945 годов, руководствуясь принципом гуманизма, в соответствии с пунктом «е» части 1 статьи 103 Конституции Российской Федерации Государственная Дума Федерального Собрания Российской Федерации постановляет:

1. Освободить от наказания в виде лишения свободы, а также от наказаний, не связанных с лишением свободы, осужденных участников Великой Отечественной войны 1941 — 1945 годов.

2. Освободить от наказания в виде лишения свободы осужденных:

а) проходивших службу в составе действующей армии либо принимавших участие в боевых действиях по защите интересов СССР и Российской Федерации после окончания Великой Отечественной войны 1941 — 1945 годов;

б) инвалидов I и II группы;

в) женщин старше 55 лет, а также женщин, имеющих несовершеннолетних детей, и беременных женщин;

г) мужчин старше 60 лет.

3. Освободить от наказания несовершеннолетних, осужденных к лишению свободы на срок до трех лет включительно и ранее не отбывавших наказание в воспитательно-трудовых колониях.

4. Освободить от наказания лиц, осужденных за неосторожные преступления к лишению свободы на срок до пяти лет включительно и отбывших не менее одной трети назначенного срока наказания.

5. Освободить от наказания лиц, условно осужденных, осужденных к лишению свободы с отсрочкой исполнения приговора, а также осужденных к наказаниям, не связанным с лишением свободы.

6. Прекратить уголовные дела, находящиеся в производстве органов дознания, следствия и судов о преступлениях, совершенных до вступления настоящего Постановления в силу:

а) лицами, указанными в пункте 1 настоящего Постановления;

б) лицами, указанными в пункте 2 настоящего Постановления;

в) несовершеннолетними, совершившими преступления, за которые предусмотрены наказания не свыше трех лет лишения свободы и ранее не отбывшими наказание в воспитательно-трудовых колониях;

г) лицами, совершившими преступления, за которые предусмотрены наказания, не связанные с лишением свободы. По делам о преступлениях, за которые предусмотрено наказание в виде лишения свободы, совершенных до вступления настоящего Постановления в силу, суд, если признает необходимым назначить наказание, не связанное с лишением свободы, освобождает осужденного от наказания.

7. Сократить неотбытую часть наказания:

а) осужденным участникам Великой Отечественной войны 1941 — 1945 годов, не подпадающим под действие пункта 1 настоящего Постановления, а также осужденным труженикам тыла, награжденным орденами и медалями СССР и Российской Федерации за самоотверженный труд в годы Великой Отечественной войны, — наполовину;

б) несовершеннолетним, не подпадающим под действие пунктов 2, 3 и 4 настоящего Постановления, и лицам, осужденным к лишению свободы за неосторожные преступления, не подпадающим под действие пункта 4 настоящего Постановления, — наполовину;

в) лицам, осужденным за умышленные преступления к лишению свободы на срок до пяти лет включительно и не подпадающим под действие пункта 2 настоящего Постановления, — на одну треть;

г) лицам, осужденным за умышленные преступления к лишению свободы на срок свыше пяти лет и не подпадающим под действие пункта 2 настоящего Постановления, — на одну четверть.

8. Не распространять действие пункта 1 настоящего Постановления на осужденных, совершивших преступления, предусмотренные статьями 77, 102, 103, частью второй статьи 108, статьей 191.2 Уголовного кодекса РСФСР, а также на лиц, признанных особо опасными рецидивистами.

9. Не распространять действие пунктов 2 — 5, подпунктов «б», «в», «г» пункта 6, подпунктов «б», «в», «г» пункта 7 настоящего Постановления на осужденных:

а) совершивших преступления, предусмотренные статьями 64, 65, 66, 67, 77, 77.1, 79, 87, 102, 103, частью второй статьи 108, статьями 117, 125, 125.1, 126.1, 147.2, 148.1, частью второй статьи 149, статьями 173, 174, 174.1, 176, 176.1, 177, 178, 179, 191.1, 191.2, 193, частью третьей статьи 206, статьями 213.2, 213.3, 218, 218.1, частью второй статьи 224, статьями 224.1, 224.2, 226.1, пунктом «в» статьи 240 Уголовного кодекса РСФСР, а также осужденных за кражу, хищение, грабеж, разбой, мошенничество и вымогательство;

б) повторно осужденных к лишению свободы за умышленные преступления;

в) признанных особо опасными рецидивистами;

г) ранее освобождавшихся от наказания в порядке акта амнистии или помилования и вновь совершивших умышленное преступление;

д) злостных нарушителей режима отбывания наказания.

10. К лицам, в отношении которых наряду с наказанием за совершенное преступление назначены меры принудительного лечения от алкоголизма, наркомании, а также к больным венерическими заболеваниями, подлежащим освобождению от наказания в соответствии с настоящим Постановлением, акт амнистии применяется по окончании полного курса лечения.

11. Настоящее Постановление вступает в силу с момента его принятия и подлежит исполнению в течение шести месяцев.

Председатель
Государственной Думы
Федерального Собрания
Российской Федерации
И.П.РЫБКИН

динамик 1ГД-52А

купить, продать динамик 1ГД-52А, цены

Описание

основные конструктивные, электроакустические и электрические данные:

внешний диаметр…………………………………………………………………….160 мм

высота……………………………………………………………………………………….55 мм

масса…………………………………………………………………………………………0,33 кг

воспроизводимый диапазон частот………………………………………100-12500 гц

уровень чувствительности…………………………………………………….90 дб

сопротивление………………………………………………………………………….4/8 ом

тип магнитной цепи………………………………………………………………….НЭ

неравномерность АЧХ……………………………………………………………..15 дб

коэффициент гармоник на частотах…………………………………….200-1000 гц- 5%

паспортная мощность……………………………………………………………..1 вт

резонанс……………………………………………………………………………………..115 гц плюс-минус 15 гц

добротность……………………………………………………………………………….

динамик применялся в абонентских громкоговорителях

Комментарии (0)

Углы и овалы. Простые мониторы с переменным сопротивлением. 1ГД-40 + 2ГД-36

Я с детства не любил овал, я с детства угол рисовал…

Колонки эти зародились неожиданно. В 1998 жизнь в стране стала налаживаться, народ начал выбрасывать старьё и у меня оказалось две ЯУЗЫ 221, два ящика венгерской фирмы BEAG, и шесть 2ГД-36 из телевизоров.

1ГД-40 из магнитофонов переехали в ящики и были установлены согласно чертежу. Эти динамики имели магнитные колпаки для экранирования поля, что позволяло устанавливать их по бокам от кинескопа компьютерного монитора. Многие публикации утверждают, что диффузор овальной формы даёт искажённое звуковое поле. Интересно, а шесть овальных излучателей должны просто таки исковеркать так называемую «сцену»?
Тем более что стоят они на расстоянии вытянутой руки.
Мои АС чем-то напоминают автомобильную акустику.

….и после тридцати лет изготовления высококачественных автомобильных акустических систем
Kroyex Company выпустила первую домашнюю акустическую систему.
— Stereo Review, June 1987

В реальности они звучат намного лучше любых пластиковых компьютерных колоночек. Они живут в мастерской и я их слушаю каждый день от усилителя Олега Гетьмана «Hi-Fi за один доллар?» на TDA2030 в классе А (журнал АудиоМагазин февраль 2002). Прижились они по одной простой причине – универсальности.

На задней стенке установлены два тумблера, позволяющие включать следующие режимы:

1 — все громкоговорители включены, общее сопротивление 16 Ом;
2 — все громкоговорители включены, общее сопротивление 4 Ом;
3 — один громкоговоритель включен, сопротивление 8 Ом;
4 — все громкоговорители выключены, кроме высокочастотника;

Для прослушивания маломощных усилителей, например ламповых однотактников, это очень удобно.

Содержание / Contents

Ящики собраны из ДСП (толщина 18 мм), мне достались оклеенные плёнкой.
Передняя и задняя стенка фанерные (толщина 10 мм). К задней стенке приклеен брусок 40х40 мм для снижения вибраций. Всё внутри оклеено ковролином и поролоном.

«Углы» в моей конструкции – это слишком сильно утопленная передняя панель. На фотографии хорошо видно, что кромка выступает миллиметров на пять. Конечно, в полученную рамку можно удобно вставить декоративную ткань, но по правилам акустики такие «углы» недопустимы.
Акустическое оформление – почти закрытый ящик.
«Почти» по одной простой причине – в режиме «один громкоговоритель включен, сопротивление 8 Ом» второй громкоговоритель работает как пассивный излучатель – низы сразу прибавляются.

Параметры динамиков

1ГД-40 обработаны раствором герлена на бензине по консистенции типа кефира. Зазор между воротником и диффузородержателем промазывают кисточкой через окна в диффузородержателе. После высыхания, всё повторить. На тыльную сторону диффузора и гофра нужно в один слой нанести герлен так, чтобы диффузор им полностью пропитался, но на его поверхности не было наплывов.

Прошу прощения за качество фотографий — делал при помощи телефонного фотоаппарата.
На фотографии видны следы обработки – более тёмный диффузор.

Старые динамики хороши ещё тем, что их много лет кто-то хорошо тренировал.
Как оказалось позже, существуют ящики таких же, размером как 15АС, какие то Бердского завода.

Камрад, рассмотри датагорские рекомендации

🌼 Полезные и проверенные железяки, можно брать

Куплено и опробовано читателями или в лаборатории редакции.

Динамики 0,5 гдш-1; 0,5 гдш-2; 1 гд-6; | Festima.Ru

Прeдлaгаю нoвыe динaмики (дpайвера), кoмплектующиe (конденсaтoры, катушки индуктивнocти, peзиcтopы, кабели внутрeннeй рaзводки) для изготовлeния и апгpeйдa акустических cиcтeм, a такжe акустичecкиe, RCА, ХLR тeрминалы, гнeздa, cиловые (сетeвые) вилки пo aдеквaтным, нe магазинным ценам. Boзмoжeн зaказ практически всeх брендов, включая: МUNDОRF, АURIСАР ХО, RIКЕ АUDIО, JАNТZЕN АUDIО, DUЕLUND. Высокочастотные (ВЧ), среднечастотные(СЧ), низкочастотные (НЧ) динамики фирм: SСАN-SРЕАК, SЕАS, sb АСОUSТIСS, АССUТОN АUDIОТЕСНNОLОGY. Демпфирующие материалы: ТWАRОN Аngеl Наir, Jаntzеn Аudiо FЕLТ, Jаntzеn Аudiо Асоustiluх роlyеstеr fоаm, Мundорrf МSilеnсе ТWАRОN Uniсоrn’s Таil. Силовые (сетевые) Shukо-коннекторы FURUТЕСН: FI-Е50NСF(R), FI-Е50(R), FI-Е48(R), FI-Е38(R), FI-Е38(G), FI-Е11(Сu), FI-Е11-N1(R), FI-Е11-N1(G). Силовые IЕС-Коннекторы FURUТЕСН: FI-15Е(Сu), FI-15Рlus(G), FI-15Рlus(R), FI-11(Сu), FI-11-N1(R), FI-11-N1(G), FI-11-N1(Аg), FI-31(G), FI-32(R), FI-8N(R), FI-50NСF(R), FI-48(R), FI-52(R). Силовые коннекторы: ОYАIDЕ (Sсhukо): Р-029е (С-029), Р-037е (С-037), Р-046е (С-046), Р-079е (С-079), Р-004е (С-004), М1е (F1). Силовые терминалы FURUТЕСН: FI-33(R), FI-33(G), FI-03(R), FI-03(G), FI-09(R), FI-09(G), FI-06NСF(R), FI-06(R), АС-1001(G), АС-1001(R), АС-1501(R). Силовые кабели в нарезку DН-LАВS: Еnсоrе (от 0,5 метра), Вulk Роwеr Рlus (от 0,5 метра), Вulk Rеd Wаvе (от 0,5 метра). Силовые кабеля в нарезку КIМВЕR: РК14 (от 1 метра), Кimbеr РК10 (от 1 метра). Силовые кабели в нарезку FURUТЕСН: FР-314Аg, FР-3ТS20, FР-3ТS762, FР-S022N (Nаnо Тесhnоlоgy), FР-S032N, FР-ТСS21, FР-ТСS31. Силовые (сетевые) розетки FURUТЕСН: FI-Е30(R), FI-Е30(G), FТ-SWS(R), FТ-SWS(G), FР-SWS(G), FТ-SWS-D(R), FР-SWS-D(R), FР-SWS-D(G), FТ-SDS(R), FТ-SDS(G). Дистрибьюторы питания FURUТЕСН: е-ТР60Е, е-ТР80Е, е-ТР609Е, е-ТР309Е. RСА разъемы (коннекторы) FURUТЕСН: СF-102(R)Sеt, СF-126(R)Sеt, FР-106(R)Sеt, FР-106(R)Вulk, FР-106(R)Sеt, FР-120F(R), FР-126(G), FР-160(G)Sеt, FТ-111(R)Sеt, RСА РАЗЪЕМЫ WВТ: WВТ-0110-Аg-4Р, WВТ-0110-Аg-2Р, WВТ-0152-Аg-4Р, WВТ-0110-Сu, WВТ-0152-Сu RСА ГНЕЗДА WВТ: WВТ-0210-Сu, WВТ-0210-Аg, WВТ-0201, WВТ-0234, Акустические коннекторы (бананы, лопатки) WВТ: WВТ-0610-Сu, WВТ-0681-Сu, WВТ-0681-Аg, WВТ-0661-Сu, WВТ-0661-Аg, WВТ-0610-Аg, WВТ-0644, WВТ-0645. Акустические терминалы WВТ: WВТ-0703-Сu, WВТ-0703-Аg, WВТ-0705-Сu, WВТ-0705-Аg, WВТ-0708-Сu, WВТ-0708-Аg, WВТ-0710-Сu, WВТ-0710-Сu-mС, WВТ-0710-Аg, WВТ-0702.01, WВТ-0702.11, WВТ-0702.12, WВТ-0730.01, WВТ-0730.11, WВТ-0730.12, WВТ-0735, WВТ-0765, Трансформаторы Lundаhl — ведущего мирового швейцарского производителя в этой области (выходные для ламповых усилителей, микрофонов, силовые и т.д.) . Припой: Мundоrf Мsоldеr (Silvеr, Silvеr/Gоld, Suрrеmе), WВТ Silvеr Sоldеr (безсвинцовый, содержание серебра 4%). Кабели внутренней разводки: DН-Lаbs silvеr рlаtеd (high реrfоrmаnсе, rеvеlаtiоn sеriеs рurе, twistеd раir), аudiеnсе Аuriс Нооkuр, аudiеnсе ОNНО mоnо сrystаl, Jаntzеn аudiо silvеr рlаtеd, Мundоrf М-Соnnесt (проводники из сплава серебра с золотом, диэлектрик РТFЕ (тефлон), сечение проводников от 0,2 до 1,8 мм²). Всегда в наличии новые конденсаторы, предохранители — аналоги известных брендов НiFI-Тuning, Furutесh, АНР, Раdis, АМR Gоld, Synеrgistiс Rеsеаrсh, Аudiо mаgiс, DНР, Sibа, Sсhurtеr. Электронные радиолампы ТJ FULL МUSIС (ТJ FULLМUSIС), SНUGUАNG, РS VАNЕ (РSVАNЕ), АК985, JJ Еlесtrоniс, Еlесtrо-Наrmоniх, Gеnаlех Gоld Liоn, Мullаrd, Тung-Sоl, Sорhiа Еlесtriс, Sоvtеk, Svеtlаnа. Компоненты для изготовления, апгрейда кроссоверов (фильтров) акустических систем (колонок), аудио аппаратуры, в том числе Sоlеn, НVL Ноvlаnd, Веnniс, Воsu, Yоntех, Wеаh, ОСVС, Веvеnbi, Аudiорhillеr (Аudiорhilеr), Sрirit, IСW. Предлагаю ознакомиться с другими моими объявлениями в профиле. Возможен заказ конденсаторов, катушек индуктивности, резисторов: Мundоrf Jаntzеn Rikе аudiо Аuriсар ХО Аudiеnсе Аuriсар Duеlund Еvох-Rifа Juрitеr JВ Сарасitоrs Intеrtесhnik Аudyn Сар Сlаrity Сар Соrnеll Dubiliеr АudiоСар ТFТ РСU Rеlсар. Встреча у метро в Москве, доставка по РФ почтой, СДЭК и т.д.

Аудио и видео техника

ПОПРАВКИ К КОНСТИТУЦИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Вносятся в соответствии с Конституцией РФ, которая предусматривает возможность их внесения. Основной закон предусматривает также возможность пересмотра его положений. Предложения о П. и пересмотре положений Конституции РФ могут вносить Президент РФ, СФ, ГД, Правительство РФ, законодательные (представительные) органы субъектов РФ, а также группа численностью не менее одной пятой членов СФ или депутатов ГД. Как следует из положений гл. 9 Конституции РФ, в тексты гл. 3–8 вносятся П., а положения гл. 1, 2 и 9 пересматриваются. При этом ФС РФ не наделено правом пересмотра положений гл. 1, 2 и 9. Если предложение о пересмотре положений гл. 1, 2 и 9 будет поддержано тремя пятыми голосов от общего числа членов СФ и депутатов ГД, то в соответствии с федеральным конституционным законом созывается Конституционное Собрание. Правила принятия П. к гл. 3–8 Конституции РФ определяются Конституцией РФ, а также Федеральным законом от 4 марта 1998 «О порядке принятия и вступления в силу поправок к Конституции Российской Федерации». П. принимаются в порядке, предусмотренном для принятия федерального конституционного закона, т. е. требуют одобрения не менее трех четвертей голосов от общего числа членов СФ и не менее двух третей голосов от общего числа депутатов ГД. Для вступления П. в силу необходимо их одобрение органами законодательной (представительной) власти не менее чем двух третей субъектов РФ. Законодательный орган субъекта РФ обязан рассмотреть закон о П. к Конституции РФ не позднее 1 года со дня его принятия. СФ на своем очередном заседании, следующем за днем истечения срока рассмотрения законодательными (представительными) органами субъектов РФ закона РФ о П. к Конституции РФ, устанавливает результаты этого рассмотрения. Если закон не получит одобрения двух третей субъектов РФ, то внесение предложений о данной П. допускается не ранее чем через 1 год. Федеральный закон предусматривает возможность обжалования постановления СФ об установлении результатов рассмотрения закона РФ о П. к Конституции РФ в Верховном Суде РФ. В случае подачи жалобы закон РФ о П. к Конституции РФ не направляется Председателем СФ Президенту РФ для подписания и официального опубликования до вступления в законную силу решения Верховного Суда РФ. Одобренный законодательными (представительными) органами не менее чем двух третей субъектов РФ закон РФ о П. к Конституции РФ в течение 7 дней со дня установления результатов его рассмотрения законодательными (представительными) органами субъектов РФ направляется Президенту РФ для подписания и официального опубликования. Принятая П. к Конституции РФ подлежит внесению Президентом РФ в текст Конституции РФ. Президент РФ в месячный срок со дня вступления в силу закона РФ о П. к Конституции РФ осуществляет официальное опубликование Конституции РФ с внесенными в нее П., а также с указанием даты вступления соответствующих П. в силу.

Постановление ГД ФС РФ от 19.05.1995 N 788-1 ГД
«Об обращении Государственной Думы Федерального Собрания Российской Федерации «К Президенту Российской Федерации в связи с направлением Президенту Российской Федерации для подписания и обнародования принятых Государственной Думой Федеральных законов»

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ДУМА ФЕДЕРАЛЬНОГО СОБРАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

ПОСТАНОВЛЕНИЕ

от 19 мая 1995 г. N 788-1 ГД

ОБ ОБРАЩЕНИИ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ДУМЫ

ФЕДЕРАЛЬНОГО СОБРАНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

«К ПРЕЗИДЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В СВЯЗИ С НАПРАВЛЕНИЕМ

ПРЕЗИДЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ДЛЯ ПОДПИСАНИЯ И

ОБНАРОДОВАНИЯ ПРИНЯТЫХ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ДУМОЙ

ФЕДЕРАЛЬНЫХ ЗАКОНОВ»

Государственная Дума Федерального Собрания Российской Федерации постановляет:

Принять обращение Государственной Думы Федерального Собрания Российской Федерации «К Президенту Российской Федерации в связи с направлением Президенту Российской Федерации для подписания и обнародования принятых Государственной Думой федеральных законов».

Председатель Государственной

Думы Федерального Собрания

Российской Федерации

И.П.РЫБКИН

ГОСУДАРСТВЕННАЯ ДУМА ФЕДЕРАЛЬНОГО СОБРАНИЯ

РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

19 мая 1995 года

ОБРАЩЕНИЕ

К ПРЕЗИДЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В СВЯЗИ С НАПРАВЛЕНИЕМ

ПРЕЗИДЕНТУ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ДЛЯ ПОДПИСАНИЯ И

ОБНАРОДОВАНИЯ ПРИНЯТЫХ ГОСУДАРСТВЕННОЙ ДУМОЙ

ФЕДЕРАЛЬНЫХ ЗАКОНОВ

В связи с возникшим вопросом о направлении Президенту Российской Федерации для подписания и обнародования принятых Государственной Думой федеральных законов Государственная Дума считает необходимым изложить свою позицию по данной проблеме.

Конституция Российской Федерации не содержит положений, конкретизирующих порядок направления Президенту Российской Федерации для подписания и обнародования федеральных законов, принятых Государственной Думой и не рассмотренных в установленные Конституцией Российской Федерации сроки Советом Федерации.

Норма, регламентирующая такую ситуацию, содержится в Регламенте Государственной Думы. Согласно части третьей статьи 116 Регламента Государственной Думы «в случаях, если принятый Государственной Думой федеральный закон не подлежит обязательному рассмотрению Советом Федерации в соответствии со статьей 106 или статьей 108 Конституции Российской Федерации и если в течение 14 дней он не был рассмотрен Советом Федерации, то в течение пяти дней данный федеральный закон направляется Государственной Думой Президенту Российской Федерации для подписания и обнародования».

Поскольку данная норма Регламента Государственной Думы не была оспорена в Конституционном Суде Российской Федерации, Государственная Дума с полным правом руководствуется ею при направлении Президенту Российской Федерации для подписания и обнародования принятых федеральных законов. Именно в таком порядке были направлены Президенту Российской Федерации для подписания и обнародования Гражданский кодекс Российской Федерации (Часть первая) и другие федеральные законы. Их подписание не вызвало никаких недоразумений, поэтому нельзя согласиться, что такая практика приводила к игнорированию мнения Совета Федерации в законодательном процессе.

Таким образом, сложился конституционный обычай, базирующийся на Регламенте Государственной Думы, и довольно долгое время законодательные и исполнительные органы власти успешно следовали этому обычаю.

Юридико-технические трудности, связанные с подписанием федеральных законов, стали возникать с того момента, когда Совет Федерации перестал считаться с положениями Конституции Российской Федерации, устанавливающими строго определенные сроки рассмотрения этой палатой принятых Государственной Думой федеральных законов.

Этим же, вероятно, следует объяснить и тот факт, что к Президенту Российской Федерации одновременно поступают два текста одного и того же федерального закона. Разумеется при этом, что подлинным является текст федерального закона, принятый Государственной Думой, так как в соответствии с Конституцией Российской Федерации (статьи 105 — 108) Совет Федерации уполномочен рассматривать принятые Государственной Думой федеральные законы, одобрять или отклонять их, но не вправе вносить в них изменения.

Положения регламентов обеих палат Федерального Собрания в развитие положений Конституции Российской Федерации устанавливают порядок рассмотрения законопроектов, порядок повторного рассмотрения Государственной Думой федеральных законов, отклоненных Советом Федерации, и порядок повторного рассмотрения федеральных законов, отклоненных Президентом Российской Федерации. Из этих положений однозначно вытекает, что изменение текста федерального закона во всех случаях возможно только Государственной Думой.

В случае рассмотрения и одобрения Советом Федерации федерального закона, принятого Государственной Думой, Совет Федерации направляет Президенту Российской Федерации без изменений именно текст федерального закона, принятый Государственной Думой.

Практика законодательной деятельности за период с января 1994 года по настоящее время подтвердила, что соблюдение установленного Конституцией Российской Федерации и регламентами палат Федерального Собрания порядка позволяет избежать недоразумений и обеспечить эффективность законодательного процесса.

Государственная Дума

Федерального Собрания

Российской Федерации

Как принимается проект федерального бюджета

Федеральный бюджет России – главное звено бюджетной системы страны. Он утверждается в форме федерального закона.

Порядок формирования и исполнения бюджета регламентируется Бюджетным кодексом РФ.

Смотрите также

Этап 1

Проект бюджета вносится в Государственную Думу каждый год до 1 октября. Одновременно с этим он направляется Президенту РФ.

После внесения в Государственную Думу проект бюджета в течение трех дней направляется в комитеты ГД для внесения замечаний и предложений, Совет Федерации и в Счетную палату РФ для подготовки заключения.

Государственная Дума рассматривает проект бюджета в течение 60 дней в трех чтениях.

Этап 2

Рассмотрение документа в первом чтении.

На этом этапе обсуждается:

концепция закона;
прогноз социально-экономического развития страны, объем ВВП и уровень инфляции;
направления бюджетной, налоговой и таможенно-тарифной политики;
объем доходов и расходов;
предельный размер внутреннего и внешнего долга.

Этап 3

Прохождение второго чтения.

Во втором чтении рассматриваются текстовая часть проекта бюджета и приложения:

бюджетные ассигнования по направлениям;
основные показатели государственного оборонного заказа;
перечень субсидий бюджетам субъектов РФ;
программа государственных внутренних и внешних заимствований страны и др.

Этап 4

Принятие в третьем чтении.

В третьем чтении законопроект выносится на голосование в целом с учетом бюджетных ассигнований, принятых во втором чтении.

Федеральный закон о бюджете в течение пяти дней со дня принятия Государственной Думой передается на рассмотрение Совета Федерации.

Этап 5

Рассмотрение в Совете Федерации.

Совет Федерации в течение 14 дней со дня представления Государственной Думой рассматривает закон о бюджете.

Этап 6

Последний этап в утверждении главного финансового документа страны — подписание бюджета Президентом РФ.

аптамер, который связывается с белком gD вируса простого герпеса 1 и эффективно ингибирует проникновение вируса

J Virol. 2012 июн; 86 (12): 6732–6744.

, ^a, ^b, ^c и ^a

Subash CB Gopinath

^a Институт биомедицинских исследований

^b Исследовательский центр наноэлектроники, Национальный институт передовых промышленных наук и технологий Цукуба City, Ibaraki

Kyoko Hayashi

^c Высшая школа медицины и фармацевтических наук, Университет Тоямы, Тояма, Япония

Penmetcha K.Р. Кумар

^a Биомедицинский научно-исследовательский институт

^a Биомедицинский исследовательский институт

^b Исследовательский центр наноэлектроники, Национальный институт передовых промышленных наук и технологий, город Цукуба, Ибараки

^c Медицинская школа и фармацевтические науки, Университет Тоямы, Тояма, Япония

Автор, ответственный за переписку.

Получено 13 февраля 2012 г .; Принято 4 апреля 2012 г.

Abstract

Эктодомен белка gD вирусов простого герпеса (HSV) играет важную роль в проникновении вирусов, связываясь со специфическими клеточными корецепторами и опосредуя проникновение вирусов в клетки-хозяева. В настоящем исследовании мы выделили аптамеры РНК (аптамер-1 и аптамер-5), которые специфически связываются с белком gD HSV-1 с высоким сродством и способны различать белок gD другого вируса, HSV-2.Аптамер-1 эффективно препятствовал взаимодействию между белком gD и рецептором клетки-мишени HSV-1 (HVEM) дозозависимым образом. По оценкам, эффективная концентрация 50% (EC ₅₀) аптамера-1 находится в наномолярном диапазоне (60 нМ). Кроме того, аптамер-1 был проанализирован на активность против HSV-1 с использованием анализов бляшек, и он эффективно ингибировал проникновение вируса с оценкой K _i 0,8 мкМ. Чтобы расширить возможности применения аптамера-1 в будущем, был разработан более короткий вариант с использованием как анализа карт, так и анализа границ, в результате чего был получен аптамер mini-1 (44-мер).По сравнению с аптамером полной длины, mini-1 имел, по крайней мере, такое же высокое сродство, специфичность и способность препятствовать взаимодействиям gD-HVEM. Эти исследования предполагают, что аптамер mini-1 может быть дополнительно изучен как местная терапия против HSV-1, предназначенная для предотвращения риска заражения HSV-1 при физическом контакте.

ВВЕДЕНИЕ

Вирус простого герпеса 1 (ВПГ-1) и ВПГ-2 являются широко распространенными патогенами человека, которые инфицируют в первую очередь эпителиальные ткани, прежде чем распространиться в нервную систему, где они становятся латентными.Геномы HSV-1 и HSV-2 имеют от 50 до 70% гомологии, и два вируса также имеют несколько перекрестно-реактивных эпитопов. Попадание HSV в клетку-хозяин начинается со связывания вирусных белков gC и gB с протеогликанами на поверхности клетки-хозяина. За этим связывающим взаимодействием следует скоординированное действие четырех основных гликопротеинов: gD, gB, gH и gL (3, 30). Из этих четырех гликопротеинов белок gD необходим для связывания со специфическими клеточными рецепторами для проникновения вируса.Белок gD распознает два белковых рецептора, медиатор проникновения вируса герпеса (HVEM) (34) и нектин-1 (25). В дополнение к этим рецепторным белкам проникновение HSV-1 может также опосредоваться 3-O-сульфатированным модифицированным гепарансульфатом (29). Белки gD HSV-1 и HSV-2 являются высокогомологичными белками с идентичностью последовательностей около 86% в области эктодомена (аминокислоты [aa] от 1 до 319).

Структуры белка gD HSV-1 были решены как в отсутствие () (4), так и в присутствии () (20) его родственного рецептора, HVEM.Недавно структура gD, связанного с другим рецептором, нектином-1, также была определена двумя группами (и d) (8, 35). Эти исследования показали, что gD содержит V-подобную складку Ig между остатками 56 и 184. Эта структурная особенность обычно обнаруживается в молекулах адгезии на клеточной поверхности. N- и C-концевые удлинения фланкируют эту складку и разворачиваются и неупорядочиваются в отсутствие рецептора gD. Однако в форме, связанной с HVEM, N-конец gD складывается в структуру шпильки, которая связывается с HVEM (4).Предполагается, что это вызванное рецептором конформационное изменение необходимо для запуска механизма проникновения вируса. С-конец эктодомена gD (остатки от 260 до 316) также играет важную роль в проникновении HSV. Carfi et al. и Krummenacher et al. (4, 20) ранее сообщали, что С-конец эктодомена gD является гибким структурным элементом, который мешает связыванию рецептора. В нелигандированной форме gD С-конец сворачивается вокруг ядра белка по направлению к N-концу, а Trp294 закрепляется в бороздке в ядре.Когда HVEM связан с gD, конец C отходит от ядра, а открытый конец N складывается в шпильку, образуя интерфейс с HVEM. Напротив, когда нектин-1 связан с gD, С-конец gD отодвигается от ядра, и Phe129 нектина-1 заменяет Trp294 gD в бороздке ядра gD. Эти авторы постулировали, что gD Trp294 играет ключевую роль в контролируемом смещении С-конца gD при связывании рецептора. Считается, что этот процесс является важным признаком проникновения ВПГ, который затем обеспечивает своевременную активацию слияния мембран (4).Таким образом, эти исследования показали, что как N-, так и C-концевые остатки белка gD играют важную роль в связывании рецептора и активации слияния мембран для проникновения вируса, соответственно.

Кристаллические структуры белка gD HSV-1 в свободной и сложной формах. (а) Кристаллическая структура gD в отсутствие рецептора. Остаток Trp294 белка gD показан в виде голубых палочек. (б) Сложная кристаллическая структура взаимодействия gD-HVEM. GD HSV-1 показан фиолетовым цветом, его N-концевые остатки (от 1 до 37) показаны синим, а рецептор HVEM показан зеленым.(c и d) Сложная кристаллическая структура взаимодействия gD-нектин-1, о которой ранее сообщили две группы (8, 35). GD HSV-1 показан фиолетовым цветом, его N-концевые остатки (от 1 до 37) показаны синим цветом, а рецептор нектина-1 показан зеленым цветом. N и C обозначают N-концевой и C-концевой концы gD HSV-1 соответственно.

Аптамеры — это редкие функционально активные молекулы, которые выбираются из библиотеки нуклеиновых кислот с помощью итеративных циклов отбора и амплификации в процессе, называемом «SELEX» (систематическая эволюция лигандов и экспоненциальное обогащение).В прошлом аптамеры изучались на диагностическом фронте, и они показали высокую способность распознавания с высоким сродством к своим родственным лигандам. Эти аптамеры могут связываться с широким кругом молекул, от простых ионов до сложных мишеней, с аффинностью, по крайней мере, столь же сильной, как сродство антител к родственным антигенам (5, 17, 33). Было разработано несколько аптамеров, нацеленных на вирусные белки, в том числе белки вируса иммунодефицита человека 1 типа (Tat, Rev, обратная транскриптаза, белок нуклеокапсид, gp120, Gag и интеграза), белки вируса Т-клеточного лейкоза 1 типа (Rex и Tax). , вирус гепатита B, белки вируса гепатита C (внутренний сайт входа в рибосомы [IRES], NS3 и РНК-полимераза), вирус иммунодефицита кошек (обратная транскриптаза), цельный вирус гриппа человека, цитомегаловирус и вирус саркомы Рауса (см. ссылку 12 и ссылки в нем).Эти аптамеры специфически ингибируют функции своих мишеней как in vitro, , так и in vivo (12). Ранее мы выбрали аптамеры, которые связывались с гемагглютинином (HA) вирусов гриппа A (h4N2) и B с высокой специфичностью и аффинностью. Эти аптамеры эффективно ингибировали слияние мембран при заражении in vitro цельными вирусами (14, 15). Интересно, что аптамер вируса гриппа A продемонстрировал высокий уровень молекулярной дискриминации близкородственных белков НА, происходящих из других штаммов в пределах того же подтипа вирусов гриппа (14).

Поскольку gD необходим для проникновения вируса для связывания со специфическими клеточными рецепторами, мы исследовали стратегию отбора in vitro , чтобы найти специфические высокоаффинные аптамеры, которые связываются с белком gD HSV-1 из полностью случайного пула нуклеиновых кислоты. После завершения восьми раундов циклов отбора и амплификации при различных условиях для каждого цикла отбора мы обнаружили, что популяция аптамеров, связывающих gD, была обогащена. После секвенирования популяции мы обнаружили, что клоны аптамера-1 и аптамера-5 преимущественно представлены в пуле (частоты 30% и 23% соответственно).Эти два аптамера связываются с высоким сродством к белку gD HSV-1 с константами равновесной диссоциации ( K _D ) 109 и 39 нМ соответственно. Эти аптамеры проявляли способность связываться с белком gD HSV-1 и различать gD HSV-1 и HSV-2. Для повышения устойчивости аптамеров к эндорибонуклеазам мы исследовали включение 2′-фторпиримидинов. После этого включения сродство аптамера-1 к gD было незначительно снижено, но сродство аптамера-5 осталось неизменным.Чтобы проверить, обладает ли аптамер-1 способностью ингибировать функции gD, такие как взаимодействие с рецептором клетки-мишени (HVEM), мы использовали подход, основанный на поверхностном плазмонном резонансе (SPR), и обнаружили, что аптамер-1 может эффективно мешают взаимодействию gD-HVEM. Аптамер-1 дополнительно анализировали на активность против HSV-1 с использованием анализов бляшек. Аптамер проявлял активность против HSV-1 со значением K _i приблизительно 0,8 мкМ. Поскольку аптамер-1 проявлял активность против HSV-1, мы использовали картирование и анализ границ, чтобы определить функциональные области аптамера-1 и разработать оптимальную длину аптамера.Более короткий аптамер, mini-1 (44-мер), эффективно связанный с gD, различает gD HSV-1 и gD HSV-2 и препятствует взаимодействию gD-HVEM. Взятые вместе, эти результаты показали, что более короткий аптамер, mini-1, был полезен для блокирования функций gD HSV-1 до того, как вирус прикрепился к родственным рецепторам на клетках-мишенях. Кроме того, mini-1 также может быть полезен в медицинском диагностическом тесте, чтобы отличить инфекцию HSV-1 от инфекции HSV-2.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусные белки.

Рекомбинантный gD HSV-1, полученный из Pichia pastoris , содержащий аминокислоты от 1 до 319, был получен либо от Cortex Biochem, либо от Vybion Inc. (Нью-Йорк, Нью-Йорк), или был экспрессирован как слитый белок с С-концевой меткой His ( От 1 до 285 аминокислот) в бакуловирусе, как описано ранее Zhang et al. (35). Мы приобрели очищенный белок gD HSV-2 в компании Vybion Inc. (Нью-Йорк, штат Нью-Йорк) (). Этот белок был гликозилирован, как это было выражено в Pichia pastoris . Оба белка gD, полученные из HSV-1 и HSV-2, используемые для анализов связывания с фильтром, были гликозилированы и экспрессированы в Pichia pastoris .С-концевой слитый белок с меткой His (аминокислоты от 1 до 285) gD HSV-1 (экспрессируемый в бакуловирусных клетках) использовали для анализов связывания gD с взаимодействиями HVEM и нектина-1 (). Белки HVEM и нектин-1 были приобретены в Sino Biological Inc. (Пекин, Китай). HVEM и нектин-1 экспрессировались в клетках человека в виде слитых белков с Fc-областью человеческого IgG и полигистидиновой меткой, соответственно, на С-конце.

Очищенные белки gD HSV-1 и HSV-2 и in vitro аптамеров, выбранных .(а) Типичный окрашенный кумасси синим гель для ПААГ, показывающий белки gD HSV-1 (аминокислоты с 1 по 285) и HSV-2 (аминокислоты с 1 по 319). (b) Олигонуклеотидные последовательности преобладающих аптамеров, обнаруженные в выбранном пуле цикла 8. Представлены предсказанные вторичные структуры аптамера-1 и аптамера-5 (BayesFold, версия 1.01). Жирным шрифтом выделена рандомизированная область РНК.

Дизайн случайного пула РНК. Библиотеки SELEX

были разработаны, чтобы содержать центральный домен рандомизированных последовательностей, фланкированных неизменными 5′- и 3′-последовательностями.Последовательность библиотеки одноцепочечной ДНК (оцДНК) TCTAATACGACTCACTATAGGAGCTCAGCCTTCAC TGC-N74-G GC ACCACGGTCGGATCCTG с 74-нуклеотидными смежными случайными последовательностями была синтезирована и фланкирована определенными последовательностями (включая промотор T7, выделенный курсивом). Определенные 5 ‘и 3′ последовательности были 5’- TCTAATACGACTCACTATAGG AGCTCAGCCTTCACTGC-3 ‘и 5′-CAGGATCCGACCGTGGTGCC-3’ соответственно. ПЦР проводили со случайной библиотекой ДНК (1 × 10 ¹⁴ молекул) с 0.25 мкМ каждый 5 ‘и 3’ праймеры. Чтобы сохранить изобилие исходной библиотеки, ПЦР была ограничена восемью циклами, чтобы избежать амплификации искаженной популяции из случайной библиотеки ДНК. Библиотека ДНК была преобразована в библиотеку РНК путем транскрипции in vitro и с использованием набора T7 Ampliscribe (Epicenter Technologies). Эту библиотеку РНК использовали для отбора.

Процедура отбора in vitro .

Селекцию проводили с использованием 15 мкг (~ 10 ¹⁴ молекул РНК) исходной библиотеки РНК в буфере для связывания РНК (50 мМ Tris-HCl, 50 мМ KCl [pH 7.5]) при молярном соотношении РНК к белку 2: 1. Во время более поздних циклов отбора концентрация белка была снижена для отбора молекул РНК с высоким сродством. РНК ненадолго нагревали до 95 ° C, а затем охлаждали до комнатной температуры для образования стабильных структур перед этапами отбора. В циклах отбора тРНК (общая тРНК из Escherichia coli ; Boehringer-Mannheim) использовали в качестве неспецифического конкурента. После инкубации РНК с целевым белком при комнатной температуре в течение 10 мин комплексы белок-РНК фильтровали через предварительно увлажненный ацетатный фильтр из нитроцеллюлозы (фильтр HAWP, 0.45 мкм и 13,0 мм; Millipore), вставленный в держатель фильтра с защелкой (Nuclepore) и промытый 1 мл связывающего буфера. РНК, оставшиеся на фильтре, элюировали и выделяли, как описано ранее (14, 15). Восстановленные РНК подвергали обратной транскрипции в 20 мкл реакционной смеси, содержащей 50 мМ трис-HCl (pH 8,0), 40 мМ KCl, 6 мМ MgCl ₂, 0,4 мМ дезоксинуклеозидтрифосфаты (dNTP), 2,5 мкМ праймер и 5 ед. обратная транскриптаза вируса миобластоза птиц (AMV) (Seikagaku). Нуклеотиды и ферменты добавляли после стадии денатурации и отжига (2 мин при 90 ° C с последующей инкубацией при комнатной температуре в течение 10 мин).Обратную транскрипцию (ОТ) проводили в течение 1 ч при 42 ° C. Полученную кДНК амплифицировали с помощью ПЦР и использовали в качестве матрицы для получения РНК для следующего раунда отбора. Для амплификации кДНК с помощью ПЦР аликвоту 20 мкл реакционной смеси обратной транскрипции (реакционная смесь кДНК) разбавляли в 80 мкл смеси для ПЦР (10 мМ Трис-HCl [pH 8,8], 50 мМ KCl, 1,5 мМ MgCl ₂, 0,1% Triton X-100, 5 ед. ДНК-полимеразы Taq [TaKaRa] и 0,4 мкМ каждого праймера). Реакционную смесь амплифицировали при следующих условиях: 94 ° C в течение 70 с, 55 ° C в течение 50 с и 72 ° C в течение 70 с.Эту программу повторяли столько циклов, сколько необходимо для получения полосы ДНК правильного размера. Продукт ПЦР осаждали этанолом и использовали для транскрипции. In vitro транскрипцию проводили при 37 ° C в течение 3 ч с помощью набора T7 Ampliscribe (Epicenter Technologies). После обработки ДНКазой I реакционную смесь фракционировали на 8% денатурирующем полиакриламидном геле. РНК извлекали из геля, определяли количественно и использовали для следующего цикла отбора и амплификации.Мы манипулировали каждым циклом отбора, чтобы гарантировать специфичность и высокую аффинность связывающих веществ HSV-1 gD. Например, мы изменили отношение РНК к gD, концентрации конкурентов и объемы буфера. Чтобы удалить связующие фильтров, которые увеличивали фон, мы использовали пластины Xenobind для третьего, пятого, седьмого и восьмого раундов отбора.

Для отбора Xenobind мы сначала покрыли лунки 5 мкг белка на миллилитр связывающего буфера и заблокировали оставшиеся участки бычьим сывороточным альбумином (БСА) (3% исходный раствор).Затем лунки промывали и использовали для отбора. В цикле отбора пул РНК из второго цикла денатурировали при 90 ° C в течение 2 минут и оставляли охлаждаться до комнатной температуры в течение 10 минут для облегчения уравновешивания различных конформеров. Объединенные РНК (0,25 мкМ) и тРНК (40 мкМ) затем смешивали в 100 мкл связывающего буфера, дважды загружали в лунки, покрытые BSA, и инкубировали в течение 10 мин при комнатной температуре (25 ° C). Затем несвязанные РНК собирали и загружали в лунки, покрытые gD HSV-1.Реакционную смесь инкубировали в этих лунках 10 мин. Несвязанные молекулы удаляли, а лунки пять раз промывали 300 мкл связывающего буфера. Связанные РНК выделяли с использованием кипящего 7 М раствора мочевины, осаждали этанолом и регенерировали с помощью RT, ПЦР и транскрипции in vitro и .

Анализ аптамеров.

Для получения индивидуальных аптамеров амплифицированные продукты ПЦР из цикла 8 напрямую лигировали в вектор pCRII (Invitrogen) в соответствии с протоколом производителя.ДНК выделяли из индивидуальных клонов методом щелочного лизиса и секвенировали с помощью набора для секвенирования Dye Terminator (Applied Biosystems Inc. [ABI]) на секвенаторе ДНК (модель 373A; ABI). Вторичные структуры аптамеров были предсказаны программой BayesFold (версия 1.01). Чтобы оценить связывание gD пулов РНК из различных циклов отбора, а также отдельных аптамеров, внутренне меченную РНК получали с использованием 0,5 мКи / мл [α- ³² P] АТФ, а исследования связывания проводили с использованием фильтра. анализ связывания аналогичен ранее описанному (15, 21, 22).Связывание и условия транскрипции in vitro и были аналогичны тем, которые использовались для отбора, за исключением концентраций белка РНК и gD. Для этого анализа мы использовали 20 нМ меченую РНК и 100 или 200 нМ белка gD, происходящего от HSV-1 или HSV-2, соответственно. Комплексы РНК-белок, оставшиеся на фильтрах, промывали 1 мл связывающего буфера и сушили на воздухе, а также количественно определяли радиоактивность с помощью анализатора изображений (BAS2000; Fuji Film). Чтобы гарантировать, что связывание было специфическим, мы провели анализы связывания в присутствии 10-кратного молярного избытка тРНК как неспецифического конкурента.

Частичная химическая модификация аптамеров.

Для повышения устойчивости РНК аптамера-1 и аптамера-5 к эндорибонуклеазам мы заменили пиримидиновые основания (остатки U и C) на 2′-фторпроизводные. Известно, что эти модификации стабилизируют РНК против эндорибонуклеаз (27). Химические модификации в аптамер-1 и аптамер-5 были введены с помощью in vitro транскрипции с использованием набора T7 Durascribe (Epicenter Technologies) в присутствии четырех типов нуклеотидтрифосфатов (2 ‘фтор [2’F] UTP, 2’ F CTP, 2’OH ATP и 2’OH GTP) на родственных им ПЦР-матрицах, которые использовали для получения немодифицированных РНК аптамер-1 и аптамер-5. In vitro транскрипцию проводили в течение ночи при 37 ° C, и транскрибированные РНК очищали с использованием метода, описанного выше. Полученные РНК имели модификацию 2′-фтор во всех пиримидиновых положениях.

Анализ взаимодействий аптамер-gD с использованием SPR-анализа.

Взаимодействия аптамер-gD анализировали с использованием оптического биосенсора BIAcore T100 при 25 ° C с сенсорным чипом, покрытым декстраном (GE Healthcare). Чтобы определить константы скорости связывания выбранных аптамеров, мы приготовили аптамеры с 24-мерными поли (A) нуклеотидами на их 3′-концах, которые могут отжигаться с комплементарным биотинилированным олиго (dT) [5′-биотин- (T) ₂₄ -3 ′].Чтобы получить эту РНК с 3′-концевым удлинением, мы использовали два праймера: прямой праймер, аналогичный тому, который использовался для отбора, и 3′-концевой праймер [5 ‘- (T) ₂₄ -CAGGATCCGACCGTGGTGCC-3′]. Матрица двухцепочечной ДНК была создана с помощью ПЦР и транскрибирована с in vitro с , как описано выше. Точно так же, комплементарные последовательности выбранных аптамер были приготовлены в качестве контроля отрицательного путем отжига шаблоны 5′-GGAGCTCAGCCTTCACTGCTGCTCTCTCCAGCAGGGGTCCCCTCTTGAGCACGAGGACCTCCGTTCA-3 ‘и 5′-CAGGATCCGACCGTGGTGCCGAACTGGTCGACTCTCGCTCGTCAGTTGAACGGAGGTCCTCGTGCT-3′, и шаблоны были дополнительно усиливается с последовательностями 5’-TC TAATACGACTCACTATA GGAGCTCAGCCTTCACTGC-3 ‘(область промотора Т7 выделена курсивом) и 5’ — (T) ₂₄ -CAGGATCCGACCGTGGTGCC-3 ‘.Первоначально биотинилированный олиго (dT) ₂₄ был присоединен к стрептавидину (чип SA; BIAcore) путем растворения олигонуклеотида в связывающем буфере (конечная концентрация 5 мкМ). Избыток или несвязанный биотинилированный олигонуклеотид смывали связывающим буфером при скорости потока 20 мкл / мин в течение 10 мин. Для анализа кинетики связывания вводили 20 мкл аптамера (конечная концентрация 100 нМ) при скорости потока 2 мкл / мин в течение 10 мин. Это привело к увеличению примерно на 1200 единиц ответа (RU) при связывании аптамера с комплементарным биотинилированным олигонуклеотидом.Кинетику одного цикла измеряли с различными концентрациями белка gD (10, 20, 40, 80 и 160 нМ), вводя белок как через экспериментальную проточную ячейку (проточная ячейка 2 [FC2]), так и через контрольную проточную ячейку ( FC1) с расходом 30 мкл / мин и общим объемом 60 мкл. Время диссоциации составляло 2 мин для получения плавной кривой. Сенсограммы корректировали на неспецифическое связывание путем вычитания кривой присоединения аптамера (FC2) к контрольной кривой (FC1) и оценивали кинетику связывания.Затем сенсорный чип промывали буферным раствором с последующей инъекцией 10 мМ раствора NaOH для удаления аптамера из биотинилированного олиго (dT) ₂₄ перед следующим анализом образца.

Анализ взаимодействий gD-HVEM и gD-нектин-1 в присутствии выбранного аптамера.

Чтобы оценить способность аптамеров вмешиваться во взаимодействия gD-рецепторов (HVEM), мы разработали анализы на основе SPR. Первоначально 100 нМ HVEM иммобилизовали на активированном чипе CM5 посредством реакции амино-сочетания с последующим блокированием непрореагировавших карбоксильных групп с помощью 1 М этаноламин-HCl (pH 8.5) на 7 мин. Иммобилизованную поверхность промывали связывающим буфером (10 мМ HEPES [pH 7,4], 150 мМ NaCl и 0,005% полисорбат 20) перед анализом взаимодействий HVEM и gD. Проточную ячейку 1 использовали в качестве контрольной поверхности, и ее активировали и гасили, как описано выше для экспериментальной проточной ячейки, за исключением добавления белка. Чтобы получить начальный ответ связывания, мы вводили 100 нМ белка gD в проточные кюветы 1 и 2. Первоначально наблюдали кривую ответа (указывающую на взаимодействия HVEM-gD).Чтобы определить влияние аптамеров на взаимодействия HVEM-gD, 100 нМ белка gD инкубировали с различными концентрациями аптамеров (0, 12,5, 25, 50, 100 и 200 нМ) при 25 ° C в течение 10 мин. Затем комплексы вводили через экспериментальную проточную кювету (FC2) и контрольную проточную кювету (FC1) в течение 2 минут со скоростью потока 30 мкл / мин. Время диссоциации составляло 2 мин. Сенсограммы корректировали на неспецифическое связывание путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной кюветы (FC1), из ответа, полученного от проточной кюветы с иммобилизованной HVEM (FC2).Затем сенсорный чип промывали буферным раствором с последующей промывкой 0,1% SDS до тех пор, пока ответ не вернулся к исходному значению для следующего анализа. Влияет ли эта регенерационная обработка на связывание HVEM с белком gD, дополнительно проверяли путем инъекции только белка gD в конце исследований, чтобы подтвердить, что HVEM сохраняет свою активность по связыванию с белком gD. Снижение ответов с увеличением концентрации аптамера использовали для расчета 50% эффективных концентраций (EC ₅₀ s) с использованием программного обеспечения Graphpad Prism 5, как описано ранее (16).

Аналогичным образом, чтобы оценить способность аптамера-1 вмешиваться во взаимодействия gD-нектин-1, 100 нМ нектин-1 иммобилизовали на активированном чипе CM5 посредством реакции аминосочетания с последующим блокированием непрореагировавших карбоксильных групп. с 1 М этаноламин-HCl (pH 8,5), как упомянуто выше. Иммобилизованную поверхность промывали связывающим буфером (10 мМ HEPES [pH 7,4], 150 мМ NaCl и 0,005% полисорбат 20) перед анализом взаимодействий нектина-1 и gD. Проточную ячейку 1 использовали в качестве контрольной поверхности, и ее активировали и гасили, как описано выше для экспериментальной проточной ячейки, за исключением добавления белка.Чтобы получить начальный ответ связывания, мы вводили 100 нМ белка gD в проточные кюветы 1 и 2. Изначально наблюдалась кривая ответа (указывающая на взаимодействия нектин-1-gD) (около 410 RU). Чтобы определить влияние аптамера-1 на взаимодействия нектин-1-gD, 100 нМ белка gD инкубировали с концентрацией аптамера-1 12,5 нМ при 25 ° C в течение 10 мин. Затем комплекс вводили как через экспериментальную проточную кювету (FC2), так и через контрольную проточную кювету (FC1) в течение 2 минут со скоростью потока 30 мкл / мин.Время диссоциации составляло 2 мин. Сенсограммы корректировали на неспецифическое связывание путем вычитания ответа, полученного от контрольной проточной кюветы (FC1), из ответа, полученного от проточной кюветы с иммобилизованным нектином-1 (FC2).

Противовирусный анализ in vitro .

Клетки Vero (почки африканской зеленой мартышки) выращивали в минимальной эссенциальной среде (MEM), содержащей 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS). HSV-1 (штамм KOS) и HSV-2 (штамм UW268) размножали с использованием клеток Vero.Для оценки цитотоксического действия аптамеров на неинфицированные клетки готовили разведения образцов и добавляли к монослоям клеток Vero в трех экземплярах. После инкубации при 37 ° C в течение 72 часов жизнеспособные клетки подсчитывали с помощью теста исключения трипанового синего и оценивали цитотоксичность. Цитотоксичность определяли путем расчета 50% цитотоксической концентрации (CC ₅₀) по кривым концентрация-ответ. Для противовирусного анализа клетки Vero инфицировали вирусом в дозе 0,1 БОЕ на клетку в течение 1 часа при комнатной температуре, промывали фосфатно-солевым буфером и затем инкубировали при 37 ° C в течение 24 часов.Аптамеры добавляли во время инфицирования и в течение всего инкубационного периода. Выход вируса определяли с помощью анализа бляшек через 1 день после инфицирования. Концентрация 50% ингибирования (IC ₅₀) была получена из кривых концентрация-ответ. Противовирусную активность аптамеров оценивали по индексу селективности, рассчитанному из CC ₅₀ s и IC ₅₀ s.

Фосфатная модификация и интерференционный анализ.

Для картирования сайтов связывания gD в выбранном аптамере был проведен анализ модификации фосфата. In vitro РНК, транскрибируемую , обрабатывали фосфатазой из кишечника теленка в течение 1 ч при 37 ° C, экстрагировали фенолом и осаждали этанолом. РНК метили [γ- ³² P] АТФ и полинуклеотидкиназой Т4, подвергали электрофорезу в геле 8% полиакриламид – 7 М мочевины и элюировали из геля. Меченой РНК давали возможность свернуться в третичную структуру путем нагревания до 95 ° C в течение 2 минут и медленного охлаждения до комнатной температуры. РНК, меченую 5′-концом (1100 кг / мин), растворяли в буфере (20 мМ HEPES [pH 8.0], 1 мМ ЭДТА и 2,5 мкг тРНК) и смешивали с 5 мкл насыщенной N -нитрозо- N -этилмочевины в этаноле. После модификации при 90 ° C в течение 2 мин реакцию останавливали добавлением к смеси 15 мкг тРНК носителя. Затем образец извлекали осаждением этанолом. Для образования комплекса аптамер-gD образец, обработанный 20 пмоль, денатурировали в 25 мкл буфера для селективного связывания при 92 ° C в течение 2 минут, а затем оставляли охлаждаться при комнатной температуре в течение 10 минут.Комплекс отделяли пропусканием через нитроцеллюлозный фильтр и частично гидролизовали в 200-мкл растворе 100 мМ трис-HCl (pH 9,0) при 50 ° C в течение 5 мин. Продукты расщепления РНК выделяли осаждением этанолом и наносили на гель 8% полиакриламид – 7 М мочевина. Аликвоты щелочного гидролизата аптамера и образца, расщепленного РНКазой Т1, подвергали соэлектрофорезу для идентификации полосы. Гель сушили и экспонировали на рентгеновской пленке для авторадиографии.

Граничный анализ.

Чтобы определить минимальный домен аптамера-1, необходимый для эффективного связывания с gD HSV-1, мы приготовили более короткую версию аптамера-1 (57-мерный, от 10 до 64 нуклеотидов с удлинением 5′-конца с двумя G остатков) и выполнили анализ границ с использованием как 3′-, так и 5′-меченых РНК. Первоначально продукт ПЦР был получен с использованием полноразмерной ДНК аптамера-1 в качестве ДНК-матрицы в присутствии прямого и обратного праймеров (5′-AGTAATACGACTCACTATAGGGCCTTCACTGCACGAGAGAGGT-3 ‘и 5′-GCCTCCAGGAGCACGAGTTC-3’ соответственно).Более короткая РНК аптамера-1 была синтезирована путем транскрипции in vitro и матриц ПЦР, созданных, как описано выше, помеченных и очищенных способом, аналогичным тому, который используется в случае полноразмерного аптамера-1. Для создания РНК разной длины меченые РНК частично гидролизовали путем инкубации с буфером для щелочного гидролиза (Ambion) в присутствии 3 мкг дрожжевой РНК при 95 ° C в течение 15 мин. Затем реакционную смесь нейтрализовали 3 М ацетатом натрия (pH 5,2) и выделяли осаждением этанолом.Эти гидролизованные меченые РНК (~ 100 тыс. Имп / мин) инкубировали с 500 нМ HSV-1 gD при комнатной температуре в течение 10 минут в связывающем буфере. Полученные комплексы были захвачены на нитроцеллюлозном фильтре, аналогичном тому, который использовался для анализов связывания фильтра, описанных выше, и связанные РНК были элюированы с фильтра путем кипячения фильтровальной бумаги при 95 ° C в течение 2 минут в 200 мкл связывающего буфера, содержащего 7 M мочевина. Элюированные РНК выделяли осаждением этанолом. Восстановленные РНК подвергали соэлектрофорезу на 10% денатурирующем геле (полиакриламид, содержащий 7 М мочевину) вместе с РНК, гидролизованной щелочью и РНКазой Т1 (Ambion), которые служили маркерами для продуктов расщепления.По завершении электрофореза полиакриламидный гель сушили и экспонировали на рентгеновской пленке для авторадиографии.

Получение аптамера mini-1 и дополнительных последовательностей.

Для получения РНК аптамера mini-1 (44-мерная) путем транскрипции in vitro , продукт ПЦР был приготовлен с использованием ДНК аптамера-1 в качестве матрицы в присутствии как прямого, так и обратного праймеров (5′-AGTAATACGACTCACTATAGGGCACGAGAGAGGTCGTCC- 3 ‘и 5′-CCAGGAGCACGAGTTCT-3’ соответственно). Вторую ПЦР проводили на той же матрице для увеличения длины на Т ₂₄ на 3′-конце с использованием праймера для удлинения Т (5′-Т ₂₄ -CCAGGAGCACGAGTTCT-3 ‘).Полученную матрицу ПЦР использовали для транскрипции in vitro и с использованием РНК-полимеразы Т7. Продукт ПЦР очищали отдельно денатурирующим ПААГ, аналогичным используемому в случае полноразмерного аптамера-1. Полученная РНК (аптамер mini-1) имеет rA24 (rAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA) на своем 3′-конце, который использовали для иммобилизации аптамеров на чипе SA через биотинилированный dT ₂₄. Аптамер mini-1 анализировали на связывание с gD HSV-1 с использованием SPR, аналогично тому, как это применялось для полноразмерного аптамера-1.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выбор высокоаффинных лигандов РНК.

Инфекция HSV требует связывания белка gD с рецепторами клеточной поверхности, и это взаимодействие необходимо для связывания рецептора и активации слияния мембран. Выбор аптамера против белка gD ВПГ человека желателен, потому что этот тип специфического зонда будет сильно влиять на разработку специфических диагностических реагентов и ингибиторов. Ранее было продемонстрировано, что аптамеры обладают высоким сродством к нескольким белкам, связывающим нуклеиновые кислоты.Кроме того, было обнаружено, что аптамеры могут распознавать различные эпитопы на поверхностных белках и что аптамеры преимущественно связываются с активными сайтами (15). Чтобы выбрать РНК-аптамер против gD HSV-1, исходный репертуар РНК был рандомизирован по 74-нуклеотидному участку, фланкированному фиксированной 38-нуклеотидной праймерной областью на 5′-конце и 20-нуклеотидной праймерной областью на 3′-конце. Этот рандомизированный пул содержал приблизительно 10 ¹⁴ единиц видов РНК в наших экспериментальных условиях, и этим видам позволяли связываться с целевым белком.Для первоначального отбора пул РНК и gD (3,6 мкМ) смешивали и инкубировали в течение 10 мин в присутствии буферных агентов, а затем свободную РНК отделяли от комплексов gD-РНК фильтрацией или с использованием планшетов Xenobind под условия, необходимые для цикла отбора. Связанные РНК выделяли в горячем 7 М растворе мочевины и затем амплифицировали с помощью обратной транскрипции, ПЦР и транскрипции in vitro и . Чтобы обеспечить большую конкуренцию между отдельными последовательностями во время циклов отбора, для начальных циклов отбора использовалось избыточное отношение пула РНК к целевому белку.Для последующих циклов отбора отношение белка gD к РНК (пул РНК и тРНК) изменяли для повышения строгости отбора (). Кроме того, неспецифический конкурент, тРНК, использовали в различных молярных соотношениях в циклах отбора, чтобы избежать отбора аптамеров с неспецифическим связыванием. После восьми раундов отбора как обогащение высокоаффинных gD-связывающих аптамеров, так и специфичность анализировали с помощью анализов связывания с фильтром. Примерно 29% пула РНК было связано с gD ().Никакого значительного удерживания выбранного пула РНК на фильтре в отсутствие gD не наблюдалось, что указывает на то, что неспецифические связывающие фильтры не коизолировались во время отбора. После восьмого цикла амплификации и отбора полученные с помощью ПЦР молекулы из пула РНК были субклонированы и секвенированы. Индивидуальные аптамеры восьмого цикла были классифицированы на основе полученных последовательностей. Аптамеры, представляющие каждую группу, анализировали непосредственно на связывание gD HSV-1 с использованием анализа связывания с фильтром.После секвенирования мы обнаружили, что в выбранном пуле преобладали два клона: аптамер-1 и аптамер-5. Эти две основные последовательности представляли частоту популяции 30% и 23% соответственно, а вместе взятые аптамеры представляли> 50% популяции в выбранном пуле 8 (). Были предсказаны первичные последовательности каждого класса аптамера, и каждый класс предполагал различные вторичные структуры в соответствии с программой BayesFold (версия 1.01) (). Оба этих аптамера были проанализированы на связывание с белком gD HSV-1 в концентрациях 100 и 200 нМ в присутствии 10-кратного молярного избытка тРНК, чтобы избежать неспецифических взаимодействий с РНК.Анализы связывания с фильтром показали разные связывания для взаимодействий gD с аптамером-1 и аптамером-5. Значения связывания аптамера-1 и аптамера-5 составляли 39% и 58% соответственно ().

Таблица 1

Циклы отбора и анализ связывания HSV-1 gD

0,5

1 70

9070 0,125 902

Цикл	Концентрация РНК пула (мкМ)	Концентрация конкурента ^b (мкМ)	Концентрация белка (мкМ)
1	8	80	3.6	0
2	4	80	3,6	ND
3 ^а	0,25	40	0,25	40
80	2,4	ND
5 ^a	0,25	40	0,2	5,3
6	0,52	ND
7 ^a	0,125	80	0,2	ND
8 64 a

Анализ связывания фильтров выбранных аптамеров. (a) Анализы связывания с фильтром проводили с немодифицированной РНК (2’OH) в присутствии белков gD (100 и 200 нМ) из HSV-1 и HSV-2, и тРНК использовали в качестве неспецифического конкурента.(b) Количества меченых аптамеров (немодифицированных), оставшихся на фильтре в присутствии и в отсутствие белков gD, определяли количественно с помощью анализатора изображений (BAS2000; Fuji Film). Были нанесены проценты связывания с белком gD HSV-1.

Специфичность связывания и константы скорости выбранных аптамеров.

Аптамеры, которые могут различать близкородственные виды, чрезвычайно полезны и помогают в разработке специфических диагностических реагентов. Ранее сообщалось, что несколько аптамеров обладают высокой способностью различать близкородственные молекулы и виды с тысячекратной дискриминационной способностью (10, 13, 17).Поскольку эктодомены белков gD HSV-1 и HSV-2 имеют 86% идентичности последовательностей, мы были заинтересованы в оценке взаимодействий выбранных аптамеров с gD, полученными из HSV-1 и HSV-2. Для первоначального анализа связывания аптамеров (аптамер-1 и аптамер-5) использовали бактериально экспрессируемый белок gD HSV-2. Для лучшего сравнения для окончательного анализа связывания мы использовали Pichia pastoris, -экспрессированный gD HSV-2, поскольку белок gD HSV-1 также экспрессировался в Pichia pastoris .Анализы связывания с фильтром ясно показали, что не было молекул, которые связывались с белком gD HSV-2, оставшимися на фильтрах при двух тестируемых концентрациях (). Этот результат показал, что выбранные аптамеры были специфичными для белка gD HSV-1 в зависимости от концентрации, даже несмотря на то, что два белка gD имеют высокий уровень сходства аминокислотных последовательностей (). Затем, чтобы улучшить стабильность этих аптамеров против эндорибонуклеаз, мы заменили все позиции пиримидина на 2′-фторцитозин и уридин.Известно, что эти химические модификации повышают устойчивость РНК к рибонуклеазам (26). Чтобы четко определить константы скорости связывания для комплексов gD аптамер-HSV-1, мы использовали анализ на основе поверхностного плазмонного резонанса с использованием прибора BIAcore T100. В этом анализе использование одноцикловой кинетики позволило нам непрерывно вводить увеличивающиеся концентрации гД ВПГ-1 (от 10 до 160 нМ) без регенерации поверхности сенсорного чипа (и b). Этот тип анализа превосходит анализ с несколькими инъекциями (18, 31).Эти анализы выявили равновесные константы скорости диссоциации ( K _D ), константы скорости ассоциации ( K _a ) и константы скорости диссоциации ( K _d ) для различных комплексов аптамер-gD () . И аптамер-1, и аптамер-5 обладают сродством к белку gD HSV-1 в наномолярном диапазоне. Напротив, комплементарная последовательность аптамера-1 (аптамер-1C) не имеет способности связываться с gD (и b), что позволяет предположить, что последовательности аптамера-1 в рандомизированных областях важны для связывания с белком gD HSV- 1.

Определение кинетических параметров взаимодействия аптамера-1 и аптамера 5 с родственным белком gD HSV-1. (a) Кинетику одноциклового связывания измеряли с аптамером-1 (немодифицированным), аптамером-1 (химически модифицированным, 2’FU и остатки C) и комплементарным аптамером-1 (аптамер-1C) в присутствии различных концентраций. белка gD (10, 20, 40, 80 и 160 нМ). (b) Кинетику одноциклового связывания измеряли с аптамером-5 (немодифицированным), аптамером-5 (химически модифицированным, остатки 2’FU и C) и комплементарным аптамером-1 (аптамер-1C) в присутствии различных концентраций. белка gD (10, 20, 40, 80 и 160 нМ).(c) Константы скорости (константа скорости ассоциации [ K _a ], константа скорости диссоциации [ K _d ] и константа равновесной скорости диссоциации [ K _D ]) для каждого комплекса аптамер-gD. отображаются.

Анализ взаимодействий gD-HVEM в присутствии аптамера-1.

Белок gD важен для связывания со специфическими клеточными рецепторами, такими как HVEM (34), нектин-1 (25) и модифицированный гепарансульфат (29). HVEM относится к семейству факторов некроза опухолей (6, 7), а нектин-1 является молекулой клеточной адгезии суперсемейства иммуноглобулинов (32).Взаимодействие с gD-рецептором было выявлено с помощью рентгеноструктурного анализа (4, 8, 35). Чтобы проверить, обладает ли аптамер-1 способностью препятствовать взаимодействию gD-рецептора (HVEM), мы создали конкурентный анализ на основе SPR (). В этом анализе HVEM иммобилизовали путем реакции аминосочетания на сенсорном чипе (CM5), и 200 нМ белка gD из HSV-1 вводили через иммобилизованную поверхность в той же проточной кювете (). При связывании gD с HVEM наблюдали сигнал ответа (~ 70 единиц ответа).Если аптамер-1 мешает взаимодействию gD-HVEM, мы предполагали, что сигнал этого ответа будет уменьшаться. Как и предполагалось, при увеличении концентрации аптамера-1 (от 12,5 до 200 нМ) сигнал связывания gD с HVEM снижался в зависимости от концентрации (). Используя ответные сигналы, была вычислена эффекторная концентрация аптамера-1, необходимая для 50% ингибирования (EC ₅₀) взаимодействий HVEM-gD, находящаяся в наномолярном диапазоне (). 2’F-модифицированный аптамер-1 (2’F-модифицированные остатки U и C) дал результаты, аналогичные результатам для немодифицированного аптамера-1 (данные не показаны).Однако аптамер-1C не мешал взаимодействиям gD-HVEM в аналогичных условиях (). Все упомянутые выше ответные сигналы были рассчитаны после вычитания ответа аптамера на контроле и поверхности HVEM (). Точно так же мы качественно проверили влияние аптамера-1 на взаимодействия нектина-1 и gD и обнаружили, что аптамер-1 также эффективно вмешивается во взаимодействия gD-нектин (). Эти анализы показали, что аптамер-1 эффективно блокирует взаимодействие между белком gD HSV-1 и родственными рецепторами HVEM и нектином-1, предполагая, что аптамер-1 может обладать сильной анти-HSV-1 активностью.

Схематическое изображение экспериментов, используемых для анализа способности аптамеров вмешиваться во взаимодействия gD-рецептора (HVEM) с использованием SPR.

Способность аптамера-1 препятствовать взаимодействиям gD-HVEM и gD-нектин-1. (а) реакции взаимодействия gD-HVEM, наблюдаемые в отсутствие аптамера-1 или при увеличивающихся концентрациях аптамера-1 (немодифицированного) в диапазоне от 12,5 до 200 нМ. Серая линия представляет инъекцию только 200 нМ аптамера. (b) Наблюдаемые ответы для каждой концентрации аптамера-1 наносили на график и оценивали ЕС ₅₀.(c) ответы взаимодействия gD-HVEM, наблюдаемые при увеличении концентраций аптамера-1С (немодифицированного). (d) Типичные необработанные сенсограммы, наблюдаемые при инъекции аптамера через проточную ячейку 1 (контрольная поверхность, чип CM5) и проточная ячейка 2 (поверхность HVEM). (e) ответы взаимодействия gD-нектин-1, наблюдаемые в отсутствие и в присутствии аптамера-1.

Аптамер-1 проявлял активность против HSV-1.

Вышеописанные исследования показали, что аптамер-1 обладает способностью блокировать взаимодействия gD-HVEM.Чтобы напрямую определить, обладает ли аптамер-1 анти-HSV-1 активностью, мы выполнили анализы бляшек с использованием штамма KOS HSV-1 в присутствии различных концентраций (до 10 мкМ) аптамера-1. Эти анализы проводились как в присутствии, так и в отсутствие 5% фетальной бычьей сыворотки (FBS), поскольку аптамер был частично стабилизирован против эндорибонуклеаз путем химической модификации РНК (2’F U и C остатки). В этом анализе мы инкубировали 2’F-модифицированный аптамер-1 с вирусами в связывающем буфере в течение 10 минут перед инфицированием клеток Vero обработанными вирусами.Наша гипотеза заключалась в том, что если аптамер-1 мешает связыванию и слиянию вируса HSV-1, мы должны наблюдать уменьшение количества бляшек с увеличением концентрации аптамера-1. Как показано на фиг.4, аптамер-1 ингибировал образование бляшек HSV-1 зависимым от концентрации образом. Однако аптамер-1C не проявлял активности против HSV-1 (). На основании этого анализа было вычислено, что IC ₅₀ аптамера-1 составляет 0,8 мкМ. Аптамер-1 не оказывал цитотоксического действия на клетки Vero и имел высокий индекс селективности (> 11).Аптамер-1 также тестировали на активность против HSV-2 (штамм UW268), и мы обнаружили, что аптамер не обладал какой-либо активностью против HSV-2. Этот результат согласуется с нашими предыдущими результатами связывания, показывающими, что аптамер-1 обладал способностью специфически связываться с белком gD HSV-1 и мог различать белок gD, полученный из HSV-1, и белок, полученный из HSV-2.

Цитотоксические и анти-HSV-1 эффекты аптамера-1. Неинфицированные и инфицированные HSV-1 клетки Vero в MEM, содержащем 5% FBS, инкубировали в течение 72 и 24 часов соответственно в присутствии аптамера-1 (а) или аптамера-1С (b).Каждое значение представляет собой среднее значение ± стандартное отклонение (SD) из трех анализов.

Вмешательство фосфатов в связывание gD HSV-1 и аптамера.

Хотя наши предыдущие эксперименты показали, что аптамер-1 потенциально может стать кандидатом в лекарство от HSV-1, аптамер-1 может создавать ограничения для будущих применений из-за длины нуклеотида в молекуле РНК. Ранее коммерциализированные и доклинически изученные аптамеры имеют типичную длину от 30 до 40 нуклеотидов (1, 2).Длина аптамера-1, используемого во всех описанных выше анализах, составляла 113 нуклеотидов. Следовательно, было важно сократить длину аптамера примерно до 40 нуклеотидов. С этой целью мы провели исследования картирования с использованием ранее описанных анализов интерференции модификаций (14, 15, 19) для определения сайтов связывания gD внутри аптамера-1. Чтобы идентифицировать важные фосфаты аптамера-1, мы использовали анализ модификации и интерференции этилнитрозомочевины (ENU). Первоначально аптамер-1 был помечен на 5′-конце и модифицирован в денатурирующих условиях (92 ° C в течение 2 мин) с помощью ENU.В этих условиях этилнитрозомочевина модифицировала фосфаты РНК примерно в 1 сайте на молекулу. Поскольку этилнитрозомочевина реагирует с фосфатами и образует фосфотриэфир в РНК, РНК может быть легко гидролизована мягкой щелочной обработкой. Алкилированной РНК позволяли связываться с gD HSV-1, и комплексные РНК отделяли от свободной РНК фильтрованием. Затем связывающие gD РНК расщепляли по модифицированным сайтам. РНК, оставшиеся на фильтре, элюировали с нитроцеллюлозных фильтров и наносили на 8% -ный полиакриламидный гель для отделения продуктов расщепления.В этом процессе молекулы, которые были модифицированы по фосфатам, которые были необходимы для связывания с мишенью, были потеряны, и эти важные расщепленные фосфатные области можно было визуализировать как след на геле для секвенирования. Сравнение интенсивностей полос в образцах комплексных и свободных РНК выявило сайты, важные для связывания gD. В частности, было обнаружено, что фосфаты в положениях с 29 по 41 сильно мешают связыванию gD, что указывает на их важность для этого взаимодействия.Кроме того, в этих взаимодействиях участвует фосфатная область в положениях с 44 по 53 (). Хотя нуклеотидные последовательности были оптимизированы в процессе отбора, фосфаты в случайных областях также могут играть важную роль в эффективном связывании gD. Когда были исследованы сайты связывания gD в предсказанных вторичных структурах аптамера-1, оказалось, что более короткий аптамер (55-мер, между положениями 10 и 64) может быть достаточным для эффективного связывания с белком gD HSV-1.Чтобы проверить, обладает ли этот более короткий аптамер-1 (55-мерная РНК) способностью связываться с gD, мы получили РНК путем транскрипции in vitro и проанализировали связывание gD с использованием анализа связывания с фильтром. Более короткий аптамер-1 (55-мерный с двумя остатками «G» на 5′-конце для облегчения эффективной транскрипции полимеразой Т7, приводящей к 57-мерной РНК) связывал gD так же эффективно, как и полноразмерный аптамер-1 (данные не показано).

Этилнитрозомочевина картирование мешающих фосфатов аптамера-1, необходимых для связывания gD HSV-1.(а) Меченые модифицированные этилнитрозомочевиной комплексы аптамер-белок улавливали нитроцеллюлозным фильтром. Фильтр обрабатывали слабым щелочным раствором. РНК выделяли и наносили на гель. Контрольные РНК-маркеры получали путем частичного расщепления нуклеазой с помощью РНКазы Т1 (дорожка Т1) или щелочного расщепления (дорожка ОН). Дорожка — обозначает РНК ENU в отсутствие gD. Дорожка + обозначает РНК ENU в присутствии gD. (b) Отображены положения ENU в предсказанной вторичной структуре аптамера-1, а возможные мешающие фосфаты отмечены звездочками.

Граничный анализ.

Пытаясь еще больше сократить длину аптамера-1 примерно до 40 нуклеотидов, мы провели анализ границ, чтобы определить 3′- и 5′-концевые границы более короткого аптамера-1 (57-мерного), которые были необходимы. для привязки к gD. Были получены продукты с 5′- и 3′-концами более короткого аптамера-1 (57-мер). Эти меченые РНК были частично гидролизованы щелочной обработкой. После восстановления после гидролиза эти РНК инкубировали с gD HSV-1.Эти 3′- и 5′-концевые РНК фильтровали через нитроцеллюлозную мембрану после связывания с белком gD HSV-1. В этой процедуре предполагалось, что фрагменты, оставшиеся на фильтре, имеют желаемую длину РНК, которая обладает всеми функциональными группами, необходимыми для связывания с gD. Чтобы определить положения и длину этих функциональных групп, мы извлекли РНК, которые оставались на фильтре после мечения 3′- или 5′-концов, и загрузили эти РНК в денатурирующий гель.Для мечения 3′-конца более короткого аптамера-1 продукты из> 45 нуклеотидов (на 14 нуклеотидов короче от 5′-конца), по-видимому, сохраняли способность связываться с белком gD HSV-1 (слева). Минимально необходимая длина РНК на основе мечения 3′-конца указана на вторичной структуре открытой стрелкой в. Прогнозы элементов вторичной структуры, одноцепочечных и двухцепочечных областей, были аналогичны с использованием либо BayesFold, либо Sfold (9). Напротив, для мечения 5′-конца более короткого аптамера-1 продукты из> 47 нуклеотидов (на 11 нуклеотидов короче от 3′-конца), по-видимому, сохраняли способность связываться с белком gD HSV-1 (справа ).Минимально необходимая длина РНК на основе мечения 5′-конца указана на вторичной структуре закрашенной стрелкой в. Длина РНК, извлеченных из меченых концом РНК, предполагает, что РНК, которые обладают последовательностью между положениями 19 и 54, способны связывать gD и удерживаться на фильтре. Эти данные свидетельствуют о том, что этой области (нуклеотиды 19–54) достаточно для связывания с белком gD (). Эти результаты согласуются с данными исследований картирования ENU, которые показали, что нуклеотиды с 20 по 53 аптамера-1 обладают сайтами связывания для gD HSV-1.

Анализ границ более короткого аптамера-1 (57-мерного), меченного на 3′- и 5′-концах РНК и образующегося в комплексе с gD HSV-1. (а) Меченый гидролизованный щелочью комплекс аптамер-белок улавливали на нитроцеллюлозном фильтре. РНК выделяли и наносили на гель. Контрольные РНК-маркеры получали путем частичного расщепления нуклеазой с помощью РНКазы Т1 (дорожка Т1) или щелочного расщепления (дорожка ОН). (b) 3′- и 5′-концевые границы, которые были идентифицированы с помощью анализа границ, обозначены открытыми и закрытыми стрелками, соответственно, на предсказанной вторичной структуре более короткого аптамера-1 (57-мер).Вторичная структура была предсказана с помощью Sfold (9; http://sfold.wadsworth.org/cgi-bin/index.pl).

Минимальный аптамер-1, который эффективно связывается с gD HSV-1.

Чтобы подтвердить открытие, что области между положениями 19 и 54 было достаточно для связывания аптамера-1 с gD, мы приготовили еще более короткий вариант, аптамер mini-1 (44-мер, представляющий нуклеотиды от 20 до 60 полноразмерного аптамера. -1 с добавлением GGG на 5′-конце для облегчения эффективной транскрипции in vitro полимеразой Т7) ().Вторичная структура аптамера mini-1 была предсказана с помощью программы Sfold (9). Мы проанализировали связывание аптамера mini-1 с gD HSV-1 с помощью анализа на основе SPR (). Анализ на основе SPR был выполнен аналогично тому, который использовался для полноразмерного аптамера-1, чтобы получить константы скорости комплекса аптамер mini-1-gD. Аптамер mini-1 связывается с белком gD с константой ассоциации ( K _a ), константой диссоциации ( K _d ) и константой равновесной диссоциации ( K _D ), равной 3.4 × 10 ⁵ л / мс, 1,1 × 10 ⁻² 1 / с и 32 × 10 ⁻⁹ M соответственно. Взятые вместе, картирование и исследования прямого связывания показали, что минимальный мотив, необходимый для связывания аптамера с gD HSV-1, сохраняется в положениях с 20 по 60 полноразмерного аптамера-1 (). Таким образом, аптамер mini-1 представляет собой самый короткий аптамер, который эффективно связывается с белком gD HSV-1. Чтобы определить, сохраняет ли аптамер mini-1 (44-мер) способность ингибировать взаимодействия gD-HVEM, мы выполнили тот же конкурентный анализ, что и для полноразмерного аптамера-1 (анализ на основе SPR) ().Как показано на фиг.4, аптамер mini-1 также препятствовал взаимодействиям HVEM-gD в зависимости от концентрации, аналогично полноразмерному аптамеру-1. Используя сигналы ответа SPR, была рассчитана эффекторная концентрация аптамера mini-1, необходимая для 50% ингибирования (EC ₅₀) взаимодействий HVEM-gD, которая находится в наномолярном диапазоне (40 нМ). Однако контрольный эксперимент с использованием комплементарной последовательности аптамера-1 не показал какого-либо вмешательства в реакцию связывания между gD и HVEM (данные не показаны).

Аптамер mini-1 и его способность связываться с gD HSV-1. (а) Прогнозируемая вторичная структура аптамера mini-1 (9). (b) Кинетика связывания за один цикл, измеренная с аптамером mini-1 (немодифицированным) и комплементарным полноразмерным аптамером-1 в присутствии различных концентраций белка gD (10, 20, 40, 80 и 160 нМ). Синяя и красная линии обозначают аптамер мини-1 и полноразмерный аптамер-1С соответственно.

Способность аптамера mini-1 (44-мер) вмешиваться во взаимодействия gD-HVEM.(а) реакции взаимодействия gD-HVEM, наблюдаемые в отсутствие или при увеличении концентраций аптамера mini-1 (немодифицированного) в диапазоне от 12,5 до 200 нМ. Серая линия представляет инъекцию только 200 нМ аптамера. (b) Наблюдаемые ответы для каждой концентрации аптамера mini-1 наносили на график и оценивали ЕС ₅₀.

ОБСУЖДЕНИЕ

Взаимодействие белка gD HSV-1 с тремя клеточными рецепторами, HVEM, нектином-1 и модифицированным сульфатом гепарина, необходимо для инициации входа в клетки посредством кооперативного фузогенного действия gD, gB и gH / gL белки (3, 30).Следовательно, желательно разработать молекулы, которые специфически связываются с белком gD HSV-1 и препятствуют его функционированию. В текущем исследовании мы выделили два аптамера, которые связываются с gD HSV-1. Аптамер-1 и аптамер-5 проявляли высокое сродство к белку gD HSV-1 в наномолярном диапазоне, и оба аптамера обладали способностью различать gD HSV-1 и HSV-2. Было также предсказано, что оба аптамера сворачиваются в структуры, подобные стеблю-петле, как показано на рис. Впоследствии эти аптамеры были частично стабилизированы за счет включения 2′-фторпиримидинов, поскольку такие модификации могут повышать устойчивость РНК к эндорибонуклеазам (27).Путем включения этих химических модификаций сродство аптамера-1 к gD было незначительно затронуто, тогда как сродство аптамера-5 осталось неизменным по сравнению с немодифицированными аптамерами (2’OH).

Чтобы оценить способность аптамера блокировать функцию белка gD (например, взаимодействие с рецептором HVEM), мы разработали анализ на основе SPR, чтобы оценить, может ли аптамер мешать взаимодействиям gD-HVEM. Для этого анализа рецептор HVEM был иммобилизован на чипе CM5 (GE Healthcare), и мы использовали gD в качестве лиганда для протекания по молекулярной поверхности HVEM.Белок gD HSV-1 связывается с HVEM с константой равновесной диссоциации ( K _D ) в наномолярном диапазоне (28). В отсутствие аптамера-1 gD связывается с HVEM. Однако с увеличением концентрации аптамера (от 12,5 до 200 нМ) взаимодействие между gD и HVEM уменьшалось. Эффективная концентрация аптамера, необходимая для ингибирования 50% взаимодействия gD-HVEM, находилась в низком наномолярном диапазоне (и b). Аптамер-1С, контроль с комплементарной последовательностью аптамера-1, не смог помешать взаимодействию gD-HVEM ().Этот результат согласуется с данными по связыванию SPR для аптамера-1C, в которых аптамер-1C не может связываться с белком gD HSV-1 (). Как немодифицированные, так и частично модифицированные (2’F) аптамеры проявляли сходные уровни ингибирования (данные не показаны), что указывает на то, что сайты связывания этих аптамеров с белком gD могут быть одинаковыми. Эти результаты свидетельствуют о том, что последовательность аптамера-1 важна для связывания и для вмешательства в взаимодействия gD-HVEM. Интересно рассмотреть, как аптамер способен различать белки gD HSV-1 и HSV-2, несмотря на их высокое сходство последовательностей.Сайт связывания аптамера в белке gD может способствовать различению белка gD HSV-1 от белка HSV-2. Аптамер-1 мог препятствовать связыванию HVEM с gD. В комплексе gD-HVEM (4) N-концевая область gD является сайтом связывания для HVEM. Однако последовательность в этой области хорошо консервативна между HSV-1 и HSV-2. Одна из возможностей заключается в том, что часть аптамера связывается с N-концевой областью gD, а другая часть аптамера связывается с другим сайтом, который различается между HSV-1 и HSV-2.Например, участки Glu86-Asp87-Val88 и Gln91-Pro92 gD, которые расположены на поверхности белка и, возможно, пространственно близки к N-концевой области, могут быть другим сайтом связывания аптамера. Другая возможность состоит в том, что аптамер связывается с отдельной областью gD и вызывает конформационные изменения на N-конце, что может привести к непродуктивным взаимодействиям с HVEM. Эти типы связывающих эффектов часто наблюдались для некоторых комплексов РНК-лиганд (23, 24).В дополнение к вышеупомянутому наблюдению мы также обнаружили, что аптамер-1 препятствует взаимодействиям между белком gD HSV-1 и нектином-1. Тем не менее, прямой структурный анализ комплекса аптамер-gD может одновременно выявить молекулярную основу различения аптамеров и пролить свет на механизм того, как аптамер вмешивается во взаимодействия между gD и его родственными рецепторами HVEM и нектином-1.

Поскольку аптамер-1 эффективно блокировал взаимодействия gD-HVEM и gD-нектин-1, которые необходимы для инфекции HSV-1, мы непосредственно протестировали аптамер-1 на противовирусную активность с помощью анализа бляшек.Для этого анализа мы использовали частично модифицированный аптамер-1 (2’F U и C включенная РНК) для частичной защиты РНК от эндорибонуклеаз. Анализы бляшек ясно продемонстрировали, что аптамер-1 обладал способностью эффективно блокировать ВПГ-1 (), но не инфекцию ВПГ-2. Индекс цитотоксичности этой РНК предполагает, что аптамер-1 оказывает минимально токсическое действие на клетки-мишени. Однако при сравнении ингибирующих эффектов аптамера-1 на взаимодействия gD-HVEM с помощью тестов на основе SPR и анти-HSV-1 было обнаружено, что аптамер-1 менее эффективен в последнем анализе.Мы полагаем, что в используемом здесь анализе анти-HSV-1 стабильность аптамера могла быть затронута, потому что частично модифицированный аптамер был защищен только от эндо-РНКазы, но не от экзорибонуклеаз. Напротив, анализ интерференции аптамера во взаимодействиях gD-HVEM и gD-нектин-1 был выполнен с очищенными белками in vitro .

Аптамер-1, использованный во всех вышеупомянутых экспериментах, имел длину 113 нуклеотидов. Однако длина аптамера для коммерческого применения обычно находится в диапазоне от 30 до 40 нуклеотидов, чтобы облегчить синтез, а также снизить стоимость синтеза.Принимая во внимание этот момент, мы выполнили картографические исследования, чтобы идентифицировать критическую область внутри аптамера-1, которая необходима для связывания gD, используя ENU и анализ границ. Как картирование, так и исследования прямого связывания показали, что минимальный мотив, необходимый для связывания аптамера с gD HSV-1, содержится в области полноразмерного аптамера-1 от положений 20 до 60 (и). Таким образом, аптамер mini-1 (44-мер) () представляет собой наименьший аптамер, который может эффективно связываться с белком gD HSV-1 и мешать взаимодействиям gD-HVEM (и).

Результаты настоящего исследования показывают, что аптамер-1 обладает уникальной способностью специфически связываться с белком gD HSV-1 с высоким сродством. Это связывание может также блокировать взаимодействия gD-HVEM и gD-нектин-1, придавая аптамеру анти-HSV-1 активность. Мы полагаем, что аптамер mini-1 теперь требует дальнейших доклинических исследований в качестве местного продукта против HSV-1, предназначенного для предотвращения или, по крайней мере, для значительного снижения риска заражения HSV-1 при физическом контакте. Одним из аспектов аптамера mini-1, который необходимо дополнительно изучить перед проведением таких исследований, является стабилизация РНК против экзорибонуклеаз на 5′- и 3′-концах.Кроме того, оказывается, что аптамер-1 или аптамер mini-1 могут быть полезны как для блокирования распознавания рецептора gD на клетках-мишенях, так и в медицинской диагностике для дифференциации инфекции HSV-1 от инфекции HSV-2.

БЛАГОДАРНОСТИ

Эта работа была поддержана внутренними грантами AIST Пенметча К. Р. Кумар.

Благодарим Hiroshi Mizuno и Emi Suenaga за полезные обсуждения.

Сноски

Опубликованы досрочно 18 апреля 2012 г.

ССЫЛКИ

1.Беккер Р.С., Чан М.Ю.
2009 г.
REG-1, схема, включающая RB-006, антагонист фактора IXa, и его олигонуклеотидный активный контролирующий агент RB-007 для потенциального лечения артериального тромбоза. Curr. Opin. Мол. Ther.
11: 707–715 [PubMed] [Google Scholar] 2.
Беккер Р.К., Повсич Т., Коэн М.Г., Рускони С.П., Салленджер Б.
2010 г.
Аптамеры нуклеиновых кислот как антитромботические средства: возможности внеклеточной терапии. Тромб. Гемост.
103: 586–595 [PubMed] [Google Scholar] 3.
Campadelli-Fiume G, Cocchi F, Menotti L, Lopez M.2000 г.
Новые рецепторы, которые опосредуют проникновение вирусов простого герпеса и альфа-герпесвирусов животных в клетки. Rev. Med. Virol.
10: 305–319 [PubMed] [Google Scholar] 4.
Карфи А. и др.
2001 г.
Гликопротеин D вируса простого герпеса связывается с человеческим рецептором HveA. Мол. Клетка
8: 169–179 [PubMed] [Google Scholar] 5.
Chu TC, et al.
2006 г.
Аптамер: конъюгаты токсина, которые специфически нацелены на опухолевые клетки простаты. Cancer Res.
66: 5989–5992 [PubMed] [Google Scholar] 6.
Кокки Ф., Менотти Л., Мирандола П., Лопес М., Кампаделли-Фьюме Дж.1998 г.
Эктодомен нового члена подсемейства иммуноглобулинов, связанный с рецептором полиовируса, имеет атрибуты настоящего рецептора для вируса простого герпеса типов 1 и 2 в клетках человека. J. Virol.
72: 9992–10002 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 7.
Коннолли С.А. и др.
2002 г.
Структурный анализ сайта связывания гликопротеина D вируса простого герпеса, присутствующего на медиаторе проникновения вируса герпеса HveA (HVEM). J. Virol.
76: 10894–10904 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 8.Ди Джовин П. и др.
2011 г.
Структура гликопротеина D вируса простого герпеса, связанного с рецептором нектина-1 человека. PLoS Pathog.
7: e1002277
doi: 10.1371 / journal.ppat.1002277 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 9.
Дин Y, Лоуренс CE.
2003 г.
Алгоритм статистической выборки для предсказания вторичной структуры РНК. Nucleic Acids Res.
31: 7280–7301 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 10.
Гейгер А., Бургсталлер П., Эльц Х.В., Рёдер А., Фамулок М.
1996 г.
РНК-аптамеры, связывающие L-аргинин, с субмикромолярными константами диссоциации и высокой энантиоселективностью.Nucleic Acids Res.
24: 1029–1036 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar]

11. Ссылка удалена.

13.
Гопинатх SCB, Баласундаресан Д., Акитоми Дж., Мизуно Х.
2006 г.
Аптамер РНК, который отличает бычий фактор IX от человеческого фактора. J. Biochem.
140: 667–676 [PubMed] [Google Scholar] 14.
Gopinath SCB, et al.
2006 г.
Аптамер РНК, который различает близкородственные вирусы гриппа человека и ингибирует опосредованное гемагглютинином слияние мембран. J. Gen. Virol.
87: 479–487 [PubMed] [Google Scholar] 15.Gopinath SCB, Sakamaki Y, Kawasaki K, Kumar PKR.
2006 г.
Эффективный аптамер РНК против гемагглютинина вируса гриппа B. J. Biochem.
139: 837–846 [PubMed] [Google Scholar] 16.
Гопинатх SCB, Шикамото Y, Mizuno H, Kumar PKR.
2007 г.
Связывающий фактор IX из змеиного яда специфически блокирует мембранное связывание человеческих факторов IX и X, опосредованное доменом гамма-карбоксиглутаминовой кислоты. Biochem. Дж.
405: 351–357 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 17.
Дженисон Р.Д., Гилл СК, Парди А, Полиски Б.1994 г.
Молекулярная дискриминация с высоким разрешением по РНК. Наука
263: 1425–1429 [PubMed] [Google Scholar] 18.
Карлссон Р., Кацамба П.С., Нордин Х., Поль Э., Мышка Д.Г.
2006 г.
Анализ серии кинетического титрования с использованием аффинных биосенсоров. Анальный. Biochem.
349: 136–147 [PubMed] [Google Scholar] 19.
Крол А, Карбон П.
1989 г.
Руководство по исследованию нативных малых ядерных РНК и структур рибонуклеопротеидов. Методы Энзимол.
180: 212–227 [PubMed] [Google Scholar] 20.
Krummenacher C, et al.
2005 г.
Структура нелигандированного gD ВПГ выявляет механизм опосредованной рецептором активации проникновения вируса.EMBO J.
24: 4144–4153 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 21.
Kumar PKR и др.
1997 г.
Выделение РНК-аптамеров, специфичных к белку NS3 вируса гепатита С, из пула полностью случайных РНК. Вирусология
237: 270–282 [PubMed] [Google Scholar] 22.
Кумаревел Т.С., Гопинатх СКБ, Нисикава С., Мидзуно Х., Кумар ПКР.
2004 г.
Идентификация важных химических групп мРНК hut для взаимодействий HutP, которые регулируют оперон hut у Bacillus subtilis. Nucleic Acids Res.
32: 3904–3912 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 23.Кумаревель Т.С., Мизуно Х., Кумар ПКР.
2005 г.
Структурная основа HutP-опосредованного анти-терминации и роли иона Mg ²⁺ и L-гистидинового лиганда. Природа
434: 183–191 [PubMed] [Google Scholar] 24.
Мацугами А. и др.
2003 г.
Структурная основа высокоэффективного захвата белка Tat ВИЧ аптамером РНК. Структура
11: 533–545 [PubMed] [Google Scholar] 25.
Монтгомери Р.И., Уорнер М.С., Лум Б.Дж., Спир П.Г.
1996 г.
Проникновение вируса простого герпеса-1 в клетки опосредовано новым членом семейства рецепторов TNF / NGF.Клетка
87: 427–436 [PubMed] [Google Scholar] 26.
Пикен В.А., Олсен Д.Б., Бенселер Ф., Ауруп Х., Экштейн Ф.
1991 г.
Кинетическая характеристика устойчивых к рибонуклеазам 2′-модифицированных рибозимов в форме головки молотка. Наука
253: 314–317 [PubMed] [Google Scholar] 27.
Rusconi CP, et al.
2002 г.
РНК-аптамеры как обратимые антагонисты фактора свертывания крови IXa. Природа
419: 90–94 [PubMed] [Google Scholar] 28.
Rux AH и др.
1998 г.
Функциональная область IV гликопротеина D вируса простого герпеса модулирует связывание гликопротеина с медиатором проникновения вируса герпеса.J. Virol.
72: 7091–7098 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 29.
Шукла Д. и др.
1999 г.
Новая роль 3-O-сульфатированного сульфата гепарина в вирусе простого герпеса 1 входа. Клетка
99: 13–22 [PubMed] [Google Scholar] 30.
Спир П.Г., Айзенберг Р.Дж., Коэн Г.Х.
2000 г.
Три класса рецепторов клеточной поверхности для проникновения альфа-герпесвируса. Вирусология
275: 1–8 [PubMed] [Google Scholar] 31.
Suenaga E, Mizuno H, Kumar PKR.
2012 г.
Мониторинг взаимодействия гемагглютинина и гликанов гриппа с использованием поверхностного плазмонного резонанса.Биосенс. Биоэлектрон.
32: 195–201 [PubMed] [Google Scholar] 32.
Такай Й., Икеда В., Огита Х., Рикитаке Ю.
2008 г.
Иммуноглобулиноподобная молекула клеточной адгезии нектин и связанный с ней белок афадин. Анну. Rev. Cell Dev. Биол.
24: 309–342 [PubMed] [Google Scholar] 33.
Томбелли С., Минунни М., Маскини М.
2005 г.
Аналитические приложения аптамеров. Биосенс. Биоэлектрон.
20: 2424–2434 [PubMed] [Google Scholar] 34.
Whitbeck JC и др.
1997 г.
Гликопротеин D вируса простого герпеса (HSV) связывается непосредственно с HVEM, членом суперсемейства рецепторов фактора некроза опухоли и медиатором проникновения HSV.J. Virol.
71: 6083–6093 [Бесплатная статья PMC] [PubMed] [Google Scholar] 35.
Чжан Н. и др.
2011 г.
Связывание гликопротеина D вируса простого герпеса с нектином-1 использует адгезию клеток-хозяев. Nat. Commun.
2: 577
doi: 10.1038 / ncomms1571 [PubMed] [Google Scholar]

275400-1-GD-T Манометр

275400-1-GD-T Манометр

Обзор

Модульный вакуумметр 275400-1-GD-T Mini-Convectron® оснащен позолоченным вольфрамовым датчиком, фитингом ISO-KF размером NW16 и нелинейным аналоговым выходом.В комплект входит одно реле уставки для защитной блокировки. Манометры Mini-Convectron® объединяют в себе высокоточный датчик Пирани с улучшенной конвекцией и электронику, чтобы обеспечить компактное, удобное, надежное и экономичное решение для измерения вакуума от атмосферного до 10 ^-4 Торр. За более чем 35 лет успешной установки в полевых условиях манометр Convectron® стал отраслевым стандартом. Это уникальная разновидность датчиков теплопроводности, в которых измерение давления основано на скорости потери тепла из провода датчика.В отличие от традиционных термопар и датчиков Пирани, которые используют только кондуктивные потери тепла, датчики Convectron используют преимущества тепловых потерь из-за конвекции при более высоких давлениях. Это расширяет диапазон точных, повторяемых измерений до атмосферы. Эти вакуумметры Granville-Phillips® идеально подходят для приложений, где критически важны размер контроллера и местное управление.

Технические характеристики

Абсолютный диапазон измерения
1.0 x 10 ^{-4 от} до 1000 торр
Цифровая связь
№
Тип
Вакуумный модуль
Дисплей
№
Интерфейс
аналог
Реле
1
Тип фитинга
NW16 ISO-KF
Ориентация при установке
Предпочтительно по горизонтали
Диапазон уставки
1×10 ^{-3 от} до 1000 торр, 1×10 ^{-3 от} до 1300 мбар, 1×10 ^-1 Па до 130 кПа
Рабочая температура
0-40 ° C, без конденсации
Максимальная температура отжига
150 ° C со снятой электроникой
Температура хранения
-40-70 ° С
Аналоговый выход
0.375-5,659 В постоянного тока (0-1000 торр, нелинейное)

Разрешение реле
2 значащих цифры
Требования к питанию
11.5 — 26,5 В постоянного тока, 0,1 А при 11,5 В постоянного тока, 1,6 Вт максимум, 1,8 максимум (с дисплеем)
Внутренний объем
40 см ³ (2.5 из ³)
Открытые материалы
Нержавеющая сталь 304, боросиликатное стекло, Ковар, оксид алюминия, сплав NiFe, полиимид
Корпус и фланец для электроники
Экструзия алюминия
Соответствие
CE
Нить
Позолоченный вольфрам
Номинал контакта уставки
1 А при 30 В постоянного тока резистивный, неиндуктивный переменный ток
Регулировка уставки
Значение, направление и гистерезис через программное обеспечение
Разъемы
Сверхминиатюрный 9-контактный штекер
Единицы
Торр
Размер шага при минимальном давлении
1 x 10 ^-4 Торр, 1 x 10 ^-4 мбар, 1 x 10 ^-2 Па

Технические характеристики

Абсолютный диапазон измерения
1.0 x 10 ^{-4 от} до 1000 торр
Цифровая связь
№
Тип
Вакуумный модуль
Дисплей
№
Интерфейс
аналог
Реле
1
Тип фитинга
NW16 ISO-KF
Ориентация при установке
Предпочтительно по горизонтали
Диапазон уставки
1×10 ^{-3 от} до 1000 торр, 1×10 ^{-3 от} до 1300 мбар, 1×10 ^-1 Па до 130 кПа
Рабочая температура
0-40 ° C, без конденсации
Максимальная температура отжига
150 ° C со снятой электроникой
Температура хранения
-40-70 ° С
Аналоговый выход
0.375-5,659 В постоянного тока (0-1000 торр, нелинейное)

Разрешение реле
2 значащих цифры
Требования к питанию
11.5 — 26,5 В постоянного тока, 0,1 А при 11,5 В постоянного тока, 1,6 Вт максимум, 1,8 максимум (с дисплеем)
Внутренний объем
40 см ³ (2,5 дюйма ³)
Открытые материалы
Нержавеющая сталь 304, боросиликатное стекло, Ковар, оксид алюминия, сплав NiFe, полиимид
Корпус и фланец для электроники
Экструзия алюминия
Соответствие
CE
Нить
Позолоченный вольфрам
Номинал контакта уставки
1 А при 30 В постоянного тока резистивный, неиндуктивный переменный ток
Регулировка уставки
Значение, направление и гистерезис через программное обеспечение
Разъемы
Сверхминиатюрный 9-контактный штекер
Единицы
Торр
Размер шага при минимальном давлении
1 x 10 ^-4 Торр, 1 x 10 ^-4 мбар, 1 x 10 ^-2 Па

Манометр, мини-конвектрон, NW16 ISO-KF, нелинейный аналог, 1 реле, вольфрам

Модель:
275400-1-GD-T

Дополнительные чертежи для этого продукта недоступны.

Введите свой адрес электронной почты ниже, чтобы сбросить пароль учетной записи.

Удалить этот продукт из списка сравнения?

Укажите номер заказа и почтовый индекс, чтобы проверить статус заказа, или загрузите счет-фактуру для заказа, который был отправлен.Войдите, чтобы просмотреть полную историю заказов.

Чтобы получить доступ к этому и другим ценным техническим ресурсам, войдите в систему или зарегистрируйте новую учетную запись в Интернете.

Также доступно в Ньюпорте.com

Код плательщика НДС имеет недопустимый формат. Он не будет сохранен вместе с заказом при отправке.

Манометр, мини-конвектрон, NW16 ISO-KF, нелинейный аналоговый, 1 реле, вольфрам

ГД-1/1.Стеклянный капилляр 2 / 1.5 / 2 с нитью / NARISHIGE GROUP Каталог продукции

Стеклянный капилляр с нитью GD-1 / 1.2 / 1.5 / 2 / NARISHIGE GROUP Каталог продукции

Стеклянный капилляр с нитью

Стеклянный капилляр с нитью, очищенный ультразвуком.

Это стеклянные капилляры с нитью внутри. Нить направляет жидкость к кончику капилляра. Их предварительно стирают в ультразвуковой стиральной машине.

Стеклянный капилляр с нитью

Спецификация

Тип	Г-1	Г-1.2	Г-1.5	Г-2	Г-3	ГД-1	ГД-1.2	ГД-1.5	ГД-2
Наружный диаметр (мм)	1	1,2	1,5	2	3	1	1,2	1,5	2
Внутренний диаметр (прибл. Мм)	0,6	0,75	0,9	0,8	1,8	0.6	0,75	0,9	1,2
Длина (мм)	90 ^*	90 ^*	90 ^*	90 ^*	90	90 ^*	90 ^*	90 ^*	90 ^*
Содержимое (шт.)	500	500	500	200	200	500	500	500	200
Материал	боросиликатный

Тип	GC-1	GC-1.2	ГЦ-1.5	ГДК-1	ГДЦ-1.2	ГДЦ-1.5	Г-100	Г-100Л	Г-1000
Наружный диаметр (мм)	1	1,2	1,5	1	1,2	1,5	1	1	1
Внутренний диаметр (прибл. Мм)	0,6	0,75	0,9	0,6	0,75	0.9	0,75	0,75	–
Длина (мм)	90	90	90	90	90	90	90 ^*	100 ^*	90 ^*
Содержимое (шт.)	200	200	200	200	200	200	500	500	200
Материал	боросиликатный

Amazon.com: Marvel Team-Up # 1 GD; Комикс Marvel: Развлечения Коллекционирование

Цена:

81 доллар.99

+ 25,99 $
перевозки

Подлинность обеспечивается	Продавец
Коллекционный Тип	оригинал
Оценка оценок	ГД — низкосортный комикс (состояние: 2/10)
Стиль	Комикс
Развлекательная франшиза	Чудо

Убедитесь, что это подходит
введя номер вашей модели.
Команда Марвел
Чудо
По сценарию Роя Томаса
В иллюстрациях Росс Андру
Мисти Найт, Человек-паук (Питер Паркер), Человек-Факел (Джонни Шторм), Песочный человек (Уильям Бейкер)

1.Нервные агенты GA, GB, GD, GF и VX: рекомендуемые уровни острого воздействия | Рекомендуемые уровни острого воздействия для отдельных переносимых по воздуху химических веществ: Том 3

хлорфон и другие органофосфаты в пренатальном развитии мозга морских свинок. Neurochem. Res. 19: 569–574.

Миодушевский, Р. Дж., С. А. Ройтер, Л. Л. Миллер, Э. Дж. Олайос, С. А. Томсон. 1998. Оценка пределов воздействия G-агентов в воздухе: критерии воздействия на профессиональное и общее население. ERDEC-TR-489, Центр исследований и разработок Эджвуда, Абердинский полигон, Мэриленд.

Миодушевски, Р.Дж., Дж. Мантеи, Р. Уэй, Д. Бернетт, Б. Гавиола, В. Мьюз, С. Томсон, Д. Соммервилл и Р. Крозье. 2000. Оценка вероятности токсичности паров зарина у крыс в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия. Труды Международной конференции по демилитаризации химического оружия (CWD-2000), Гаага, Нидерланды. 21–24 мая 2000 г.

Миодушевски, Р.Дж., Дж. Мантеи, Р. Уэй, Д. Бернетт, Б. Гавиола, В. Мьюз, Дж. Энтони, Д. Дерст, Д. Соммервиль, Р. Крозье, С.Томсон и К.Кроуз. 2001. Программа низкоуровневой оперативной токсикологии ECBC: Фаза I — ингаляционная токсичность паров зарина у крыс в зависимости от концентрации и продолжительности воздействия. ECBC-TR-183, Центр исследований и разработок Эджвуда, Абердинский полигон, Мэриленд (август 2001 г.).

Миодушевски, Р.Дж., Дж. Мантеи, Р. Уэй, Д. Бернетт, Б. Гавиола, В. Мьюз, С. Томсон, Д. Соммервилл и Р. Крозье. 2002a. Взаимодействие концентрации и продолжительности воздействия при определении острых токсических эффектов паров зарина на крыс.Toxicol. Sci. 66: 176–184.

Миодушевски, Р. Дж., Дж. Мантеи, Р. Уэй, Д. Бернетт, Б. Гавиола, В. Мьюз, С. Томсон, Д. Соммервилл, Р. Крозье, Дж. Скотто, Д. Маккаски, К. Краус и К.Матсон. 2002b. Воздействие паров низкого уровня зарина на крыс: влияние концентрации и продолжительности воздействия на размер зрачка. ECBC-TR-235. Эджвудский химико-биологический центр, солдат армии США и биологическое химическое командование, Абердинский испытательный полигон, Мэриленд (май 2002 г.).

MODa (Министерство обороны). Неопубликованный отчет.Обнаружение газов G по запаху. Соединенное Королевство, Министерство обороны. (Цитировано по Marrs et al. 1996.)

Морган, Д.П. 1989. Распознавание и борьба с отравлениями пестицидами. 4-е изд. EPA-540 / 9–88–001. Агентство по охране окружающей среды США, Вашингтон, округ Колумбия

Х. Морита, Н. Янагисава, Т. Накадзима, М. Шимидзу, Х. Хирабаяси, Х. Окудера, М. Нохара, Ю. Мидорикава и С. Мимура. 1995. Отравление зарином в Мацумото, Япония. Ланцет 346: 290–293.

Мамфорд, С.А. 1950.Физиологическая оценка нервно-паралитических газов. Меморандум Портона № 39.

Мангер, Дж. С., Дж. П. Ши, Э. А. Марк, Д. Т. Чин, К. Джерард, Х. А. Чепмен. 1991. Серинэстераза, выделяемая альвеолярными макрофагами человека, тесно связана с микросомальными карбоксилэстеразами печени. J. Biol. Chem. 266: 18832– 18838.

Манро, Н. Б., А. П. Уотсон, К. Р. Эмброуз, Г. Д. Гриффин. 1990. Лечение воздействия боевых отравляющих веществ: последствия для поставщиков медицинских услуг и планирования действий в чрезвычайных ситуациях в общинах.Environ. Перспектива здоровья. 89: 205–215.

LC-GD-10-1-2020: Европейские возможности для обсуждения и участия граждан в «Зеленой сделке»

Описание
звонка
«LC-GD-10-1-2020: Европейские возможности для обсуждения и участия граждан в« Зеленой сделке »»

Все
области Европейского зеленого курса, от действий по борьбе с изменением климата до нулевого загрязнения, требуют активной поддержки граждан на всех этапах
переходы.Реальные решения, принятые и принятые в широком масштабе, могут быть найдены только при активном участии
все это касается. Это особенно характерно для сложных вопросов, в которых на карту поставлены разные точки зрения или интересы, например, проблемы села и города.
пробелы, отношение к биоэкономике, управлению водными ресурсами, выбору источников энергии и т. д. Такие вопросы лучше всего решать
через процессы участия с участием граждан из разных слоев общества по всей Европе, в том числе путем вовлечения
их на протяжении всего жизненного цикла инноваций как социальных новаторов.Конференция о будущем Европы еще более повысила
осознание необходимости процессов участия и возросшие ожидания в этом отношении. Сильные ожидания гражданина
участие также было повышено в контексте подготовки Horizon Europe, в частности для миссий Horizon Europe,
что будет иметь прямое отношение к «Зеленому курсу Европы».

Такие процессы могут включать в себя широкий спектр совместного творчества.
мероприятия и мероприятия, основанные на диалоге и обмене информацией, в том числе, но не ограничиваясь виртуальными.Условия
процессы участия различаются в зависимости от целей и ожидаемых результатов, от использования разнообразия знаний и ожиданий
и мнения в целях повышения качества знаний и обогащения материалов для обсуждения политики; вплоть до создания «мини-пабликов»
чтобы расширить арену общественного обсуждения и повысить репрезентативность политических решений. Для этих процессов
Чтобы быть эффективными, участники должны быть оснащены соответствующими инструментами и информацией, они должны быть тесно связаны
органам, принимающим решения — примеры простираются от простых механизмов обратной связи до составления бюджета на основе участия — и они должны быть
уполномочены размышлять, обдумывать и предлагать изменения на системном уровне.

Процессы участия в целом и граждан
обсуждение, в частности, требует различного уровня знаний, а также предварительного разъяснения этических и методологических
принципов и четкой приверженности институтов результатам процессов. Успешный опыт был
возглавил на европейском, национальном и местном уровнях, который выиграет от расширения, структурирования и масштабирования. Более того, такие действия
должны сопровождаться сравнительными исследованиями и обратной связью для обеспечения непрерывного мониторинга, оценки и обучения.

Объем:

Эта тема охватывает обсуждение и участие граждан. Действия должны
создавать транснациональные сети экспертов, исследователей, практиков и соответствующих организаций гражданского общества, специализирующихся
в совещательной демократии и гражданском участии по всей Европе, включая профессионалов в области общественного участия.
Также следует включить экспертов по гендерному равенству и климатической справедливости. Они должны делиться передовым опытом, инструментами и ресурсами.
и внедрить процессы участия и обсуждения по приоритетным вопросам для достижения Зеленого курса, как на
на уровне местных сообществ и в более широком масштабе.Они должны установить связь посредством разнообразного участия и обсуждения.
процессы в регионах и странах вплоть до европейского уровня. Они должны основываться на уже существующем опыте и инструментах,
особенно проекты с открытым доступом, вытекающие из проектов, финансируемых ЕС, таких как RRI
Платформа инструментов.

Действия должны включать в себя несколько совещательных процессов, каждый из которых должен быть реализован в значительной степени.
число государств-членов или ассоциированных стран и дополнено европейской многоязычной дискуссионной платформой онлайн.Конкретные темы для обсуждения должны быть согласованы со службами Европейской комиссии, участвующими в реализации Зеленого
Иметь дело. Они должны поддерживать основные действия ЕС, в которых участие общественности играет ключевую роль, включая, помимо прочего, Horizon Europe.
Миссии в тесном сотрудничестве с соответствующими советами миссий и другие инициативы в области НИОКР.

Сбалансированный комбинезон
охват ЕС и ассоциированных стран следует искать.Уязвимые и маргинальные категории населения, меньшинства
и различные возрастные группы, включая молодежь и старшее поколение, а также городские, пригородные и сельские районы, должны
учитываться при анализе и включаться в обсуждения. Гендерный баланс должен быть обеспечен, и гендерные вопросы должны получить
особое внимание.

Национальные и местные органы власти и администрации должны быть тесно связаны с самого начала
стадии, включая, насколько это возможно, связи с существующими дебатами и процессами участия на их уровнях и принятие
учет национальных / местных особенностей.Четкие каналы для использования результатов совместного участия в процессах принятия решений
следует искать на местном, национальном и / или европейском уровнях и обеспечивать обратную связь с гражданами.

Действия следует проектировать
методики для каждого отдельного упражнения, основанные на сравнительном анализе международной практики и с привлечением людей
или заинтересованные группы. В зависимости от своих конкретных целей они могут обеспечить согласованность между государствами-членами / ассоциированными организациями.
Страны для транснациональной сопоставимости или выберите ряд различных методологий для сравнения их эффективности.

An
Консультативный совет должен гарантировать надежность, этичность и инклюзивность запланированных совещательных процессов и
методики и условия выполнения каждого отдельного упражнения.

Действия следует также изучить каждому в отдельности
тренировать, оценивать и сравнивать свои результаты в государствах-членах / ассоциированных странах, а также предоставлять отзывы и рекомендации.

Предложения
следует выделить ресурсы для координации и сотрудничества с другими проектами, финансируемыми в этой области, поскольку
обсуждение и участие являются важными факторами для изменения поведения и тесно связаны с вовлечением граждан
и активизм.Такое сотрудничество может включать создание единого консультативного совета по каждой теме для обеспечения единообразия
проекты и / или единую онлайн-платформу, чтобы максимально увеличить ее охват и влияние.

В соответствии со стратегией Союза в области международного
поощряется сотрудничество в области исследований и инноваций, международное сотрудничество.

Проекты в этой теме позволят
коллективная разработка и ответственность за цели и средства Европейского зеленого курса, участие и изменения через участие граждан
и процессы обсуждения.Консорциумы должны выбрать корзину качественных и количественных показателей для измерения воздействия
их работы и рекомендуется использовать индикаторы MoRRI.

Ожидаемое воздействие:

Успешно
ожидается, что проекты внесут свой вклад в конкретные воздействия, в том числе:

чувство сопричастности и вовлеченности через
обсуждение и участие граждан по всей Европе;
совместное определение решений, способствующих
Европейская зеленая сделка;
более активное участие граждан в реализации «Зеленого курса Европы» и
будущие миссии Horizon Europe;
рост доверия к политическим и научным институтам среди граждан, пользующихся услугами European Green
Проблемы со сделкой;
приверженность и поддержка широкого спектра социальных групп по всей Европе в поддержку европейской зеленой
Согласовывать цели и участвовать в создании и совместной реализации путей перехода, включая активизацию граждан через
социальные инновации;
в долгосрочной перспективе вклад в достижение одной или нескольких целей в области устойчивого развития.

Мартинес стартует за Гондурас на Олимпийских играх

Гондурас открыл олимпийский турнир в четверг с высокими ожиданиями после полуфинального забега на Олимпийских играх 2016 года в Бразилии. Однако поражение со счетом 1: 0 от Румынии на стадионе «Кашима» в первом матче группового этапа создало сложный путь к повторению этого подвига.

Нападающий «Реала Солт-Лейк-Сити» Дуглас Мартинес заработал для Гондураса старт на правом фланге в схеме 4-4-2 и почти забил гол в первом тайме от Хорхе Бенгуче, выведя «Олимпию» вперед за обороной Румынии на 39-м месте. минута.Бенгуче обогнул вратаря, но его удар оказался под серьезным углом, и он был переведен на угловой.

Гондурас обыграл Румынию со счетом 11: 4 в первом тайме и выглядел готовым к прорыву, даже когда Румыния взяла под контроль мяч. Затем, после того как Гондурас пропустил угловой, автогол вывел Румынию вперед 1: 0 в перерыве между таймами. Мяч вошел с левого фланга и выглядел так, будто вратарь Алекса Гити легко схватился, но мяч попал в сетку дальней стороны защитника Гондураса Элвина Оливы.

Сделав одну поправку в перерыве между таймами, тренер «Гондураса» Мигель Фалеро вывел на место Майкла Перелло, чтобы заменить Гити, и на 57-й минуте в игру вступил бывший нападающий «Реала Монархов» Луис Пальма. Чтобы открыть вторую половину, Гондурас угрожал, и Мартинес головой навесил от Хорхе Альвареса, но промахнулся на 59-й минуте. Это давление сохранялось на протяжении всего второго тайма, поскольку Гондурас искал уравнительного игрока. По мере нарастания отчаяния оборона Румынии продолжала подавлять.Мартинес сделал еще один удар на 90-й минуте, но промахнулся, и Румыния продолжила игру до победы 1: 0.

В другом месте в группе B Новая Зеландия победила Южную Корею со счетом 1: 0 в первом матче на стадионе «Кашима», забив гол от форварда «Бернли» Криса Вуда, чтобы быстро контролировать группу.

Гондурас встретится с Новой Зеландией в воскресенье в 2 часа ночи.

В другой игре в четверг чемпионы Concacaf Мексика разгромили Францию со счетом 4: 1 и вышли на первое место в группе А, в то время как принимающая Япония обыграла Южную Африку 1: 0 и вышла на второе место в группе.В группе C Египет и Испания сыграли до нулевой ничьей, а Австралия шокировала Аргентину победой со счетом 1: 0, поднявшись на вершину турнирной таблицы. Группа D открылась с того, что Кот-д’Ивуар выиграл у Саудовской Аравии 2: 1, а Бразилия получила хет-трик в первом тайме от Ричарлисона и удержала победу над Германией 3: 2.

Новая Зеландия (1-0-0, 3 очка, +1 GD)
Румыния (1-0-0, 3 очка, +1 GD)

Южная Корея (0-1-0, 0 очков, -1 GD)
Гондурас (0-1-0, 0 очков, -1 GD)

Две лучшие команды из каждой группы проходят в четвертьфинальный раунд.

Постановление ГД ФС РФ от 19.04.1995 N 713-1 ГД

динамик 1ГД-52А

Описание

Комментарии (0)

Углы и овалы. Простые мониторы с переменным сопротивлением. 1ГД-40 + 2ГД-36

Содержание / Contents

Камрад, рассмотри датагорские рекомендации

🌼 Полезные и проверенные железяки, можно брать

Динамики 0,5 гдш-1; 0,5 гдш-2; 1 гд-6; | Festima.Ru

ПОПРАВКИ К КОНСТИТУЦИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Как принимается проект федерального бюджета

Смотрите также

аптамер, который связывается с белком gD вируса простого герпеса 1 и эффективно ингибирует проникновение вируса

Subash CB Gopinath

Kyoko Hayashi

Penmetcha K.Р. Кумар

Abstract

ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Вирусные белки.

Дизайн случайного пула РНК. Библиотеки SELEX

Анализ аптамеров.

Частичная химическая модификация аптамеров.

Анализ взаимодействий аптамер-gD с использованием SPR-анализа.

Анализ взаимодействий gD-HVEM и gD-нектин-1 в присутствии выбранного аптамера.

Фосфатная модификация и интерференционный анализ.

Граничный анализ.

Получение аптамера mini-1 и дополнительных последовательностей.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Выбор высокоаффинных лигандов РНК.

Таблица 1

Специфичность связывания и константы скорости выбранных аптамеров.

Анализ взаимодействий gD-HVEM в присутствии аптамера-1.

Аптамер-1 проявлял активность против HSV-1.

Вмешательство фосфатов в связывание gD HSV-1 и аптамера.

Граничный анализ.

Минимальный аптамер-1, который эффективно связывается с gD HSV-1.

ОБСУЖДЕНИЕ

БЛАГОДАРНОСТИ

Сноски

ССЫЛКИ

275400-1-GD-T Манометр

Обзор

Обзор

Технические характеристики

Технические характеристики

Модель: 275400-1-GD-T

Также доступно в Ньюпорте.com

ГД-1/1.Стеклянный капилляр 2 / 1.5 / 2 с нитью / NARISHIGE GROUP Каталог продукции

Стеклянный капилляр с нитью

Стеклянный капилляр с нитью, очищенный ультразвуком.

Стеклянный капилляр с нитью

Спецификация

Amazon.com: Marvel Team-Up # 1 GD; Комикс Marvel: Развлечения Коллекционирование

LC-GD-10-1-2020: Европейские возможности для обсуждения и участия граждан в «Зеленой сделке»

Мартинес стартует за Гондурас на Олимпийских играх

alexxlab

Добавить комментарий Отменить ответ

Модель:
275400-1-GD-T