Соль при гв: Соль для ребенка и кормящей мамы

[18] Г.В. Кузнецов, Д. Феоктистов, Э. Орлова, Испарение капель жидкости

с поверхности анодированного алюминия, Теплофизика. Аэромех. 23 (2016) 17–

22, https://doi.org/10.1134/S0869864316010029.

[19] Н. Шахидзаде-Бонн, С. Рафаи, Д. Бонн, Г. Вегдам, Кристаллизация соли во время испарения

: влияние межфазных свойств, Langmuir 24 (2008) 8599–8605,

https: // doi.org / 10.1021 / la8005629.

[20] M. Hoorfar, A.W. Neumann, Недавний прогресс в анализе осесимметричной формы капли

(ADSA), Adv. Коллоидный интерфейс Sci. 121 (2006) 25–49, https://doi.org/

10.1016 / j.cis.2006.06.001.

[21] А.Ф. Сталдер, Г. Кулик, Д. Сейдж, Л. Барбьери, П. Хоффманн, Змеиный подход

к точному определению как точек контакта, так и углов контакта, Colloids

Surf. А 286 (2006) 92–103, https://doi.org/10.1016/j.colsurfa.2006.03.008.

[22] Й. Гоцлавски, В. Урбаниак-Домагала, Метод измерения краевого угла твердое тело – жидкость

с использованием изображений лежащих капель с тенями на субстрате,

Труды Memstech Львов-Поляна, Украина, 2007, С. 135–140. DOI:

10.1109 / memstech.2007.4283447

[23] D.L. Уильямс, А. Кун, М.А.Аманн, М. Хаузингер, М. Конарик, Э.

Нессельроде, Компьютерное измерение углов смачивания, Galvanotechnik

101 (2010) 2502–2512.

[24] А. Батени, С.С. Суснар, А. Амирфазли, А.В. Нейман, Полином с высокой точностью

, подход к определению углов смачивания, Colloids Surf. A 219 (2003) 215–

231, https://doi.org/10.1016/s0927-7757(03)00053-0.

[25] А. Батени, С. Лотон, Х. Тавана, С.С. Суснар, А. Амирфазли, А.В. Neumann,

Влияние электрических полей на угол смачивания и поверхностное натяжение капель, J. Colloid

Interface Sci. 283 (2005) 215–222, https: // doi.org / 10.1016 / j.jcis.2004.08.134.

[26] Г.В. Кузнецов, Д. Феоктистов, Э. Орлова, Режимы растекания капли воды

по подложкам с различной смачиваемостью // Журн. Phys. Термофиз. 89

(2016) 317–322, https://doi.org/10.1007/s10891-016-1381-0.

[27] S.Y. Мисюра, В. Накоряков, С. Елистратов, Неизотермическая десорбция

капель сложного состава, Thermal Science 16 (2012) 997–1004,

https://doi.org/10.2298/TSCI120428116N.

[28] А.В. Бараненко, С.В. Караван, О.А. Пинчук, Д. Караван, Водные растворы абсорбционных термопреобразователей

, Издательство «Перо», Санкт-Петербург,

2014.

[29] Э.Г. Орлова, Д. Феоктистов, Г. Кузнецов, К. Пономарев, Распространение капли дистиллированной воды

на полированные и обработанные лазером алюминиевые поверхности,

European J. Mech. — B / Fluids 68 (2018) 118–127, https://doi.org/10.1016/j.

евромех fl у.2017.12.002.

[30] Р.Д. Диган, О. Бакаджин, Т.Ф. Дюпон, Г. Хубер, С. Нагель, Т. Виттен, Капиллярный поток

как причина кольцевых пятен от высохших жидких капель, Nature 389 (1997)

827–829, https://doi.org/10.1038/39827.

[31] О.И. Верба, В. Груздев, Л. Захаренко, Термодинамические свойства воды

растворов бромида лития, в кн .: Теплофизические свойства растворов,

Институт теплофизики, Новосибирск, 1983, с. 19–34.

[32] В.А. Груздев, О. Верба, Давление насыщенных паров водных растворов бромида лития

// Исследование теплофизических свойств жидких растворов и сплавов

, Институт теплофизики, Новосибирск, 1977, с.

5–19.

[33] В.Е. Накоряков, Н. Григорьева, Неизотермическое поглощение в термотрансформаторах

, Наука, Новосибирск, 2010.

[34] Гроссман Г. Одновременный тепломассоперенос в пленочном поглощении при ламинарном течении

// Прикл.J. Heat Mass Transf. 26 (1983) 357–371, https://doi.org/

10.1016 / 0017-9310 (83) -6.

[35] Т. Мейер, Улучшение точных аналитических решений для задач комбинированного нагрева и

массопереноса, полученных с помощью метода Фурье, Междунар. J.

Холодильник. 43 (2014) 133–142, https://doi.org/10.1016/j.ijrefrig.2014.04.005.

[36] Т. Мейер, Ф. Циглер, Аналитическое решение для комбинированного тепломассопереноса в ламинарном поглощении падающей пленки

с использованием граничных условий первого типа на границе раздела

, Int.J. Heat Mass Transf. 73 (2014) 141–151, https://doi.org/10.1016/

j.ijheatmasstransfer.2014.01.074.

168 Г.В. Кузнецов и др. / International Journal of Heat and Mass Transfer 126 (2018) 161–168

Соленый вкус молочных продуктов: можем ли мы уменьшить количество соли?

Открытый архив в партнерстве с Американской ассоциацией молочных наук (ADSA)

открытый архив

Реферат

Натрий можно найти во многих источниках питания в США. В настоящее время диетические рекомендации предполагают максимальное потребление 2300 мг натрия (6 г хлорида натрия) в день, тогда как среднее потребление потребителем составляет 3600 мг натрия (9 г хлорида натрия) в день.Основная проблема для здоровья при высоком потреблении натрия — гипертония. Цели этого исследования состояли в том, чтобы определить интенсивность соленого вкуса хлорида натрия в воде и различных молочных пищевых матрицах, а также выявить едва заметную разницу в концентрации, при которой потребители заметили уменьшение соленого вкуса в этих пищевых продуктах. Растворы и пищевые продукты (вода, сырный соус, творог и суп на основе молока) готовили с хлоридом натрия в концентрации от 0.008 до 0,06 M . Семнадцать участников оценили интенсивность солености каждого продукта в трех экземплярах, используя шкалу оценки величины. В последующих тестах участники группы (n = 50) оценивали интенсивность солености этих пищевых продуктов в отдельных сессиях, используя метод выбора восходящей силы, чтобы определить едва заметную разницу. Приемочные испытания для потребителей (n = 75 потребителей) проводились с творогом с пониженным содержанием натрия и без него, а также в условиях с и без пользы для здоровья от снижения содержания натрия.Данные шкалы оценки величины были преобразованы в логарифмически, и все данные были проанализированы с помощью дисперсионного анализа с наименьшей значимой разницей Фишера для разделения средних. Линейная пропорция степенной функции на кривой интенсивности соленого вкуса для растворов хлорида натрия и трех пищевых продуктов составляла от 0,03 до 0,20 M . Потребители смогли заметить и правильно определить снижение концентрации соли менее чем на 20% во всех продуктах. Когда потребители были проинформированы о снижении содержания натрия и его пользе для здоровья перед дегустацией творога с низким содержанием натрия (4–12%), общая оценка творчества с низким содержанием натрия не отличалась от творога с высоким содержанием натрия.Эти результаты показывают, что снижение содержания натрия в сырном соусе, твороге и супах на основе молока может быть сложной задачей и что исследование альтернатив хлориду натрия в этих продуктах является оправданным. Соответствующее позиционирование продукта или реклама могут быть полезными для принятия потребителями продуктов с низким содержанием натрия.

Ключевые слова

хлорид натрия

сенсорный

уменьшение

пищевое применение

Рекомендуемые статьи Цитирующие статьи (0)

Copyright © 2011 American Dairy Science Association.Опубликовано Elsevier Inc. Все права защищены.

Рекомендуемые статьи

Цитирующие статьи

Общественное производство соли для солнечной энергии в Гоа, Индия | Aquatic Biosystems

Гоа, вместе с Даманом и Диу, был провинцией под португальским владычеством с 1510 года и назывался Estado da India . Гоа был аннексирован Индией 19 декабря 1961 года и освобожден от португальского владычества [1]. Солнечное производство соли в Гоа было важным видом деятельности на протяжении всей его истории.

В Гоа тропический муссонный климат с жарким летом, за которым следуют продолжительные муссоны с июня по октябрь. В Гоа 9 рек, большинство из которых образуют устья, главными из которых являются реки Мандови и Зуари. Летом в этих реках наблюдается высокий приливный приток, поэтому соленость меняется в сезон дождей (2–3 ° B) и в немусонное время (4–5 ° B) [2]. Различные факторы, такие как благоприятные климатические условия и легкая доступность морской воды, способствовали производству соли за счет естественного испарения в Гоа.

Сегодня производство солнечной соли находится в упадке из-за низкого уровня доходов, конкуренции со стороны йодированной соли промышленного производства, ежегодного повреждения и ремонта набережных и загрязнения. В настоящее время существует 9 деревень, производящих соль, в каждой из которых есть несколько действующих соляных бассейнов.

Историческая справка

Солнечное производство соли в Гоа, описанное как традиционная деревенская промышленность, практикуется в течение последних 1500 лет различными общинами [3, 4].Поскольку большинство рек образуют устья и испытывают приливные притоки, добыча соли была начата в основном в прибрежных деревнях. Соль также служила важным товаром для торговли, играя важную роль в экономике Гоа. Соль, производимая в соляных котлах Гоа, считалась высококачественной и экспортировалась в Бирму, Таиланд и другие азиатские страны [5]. С португальской колонизацией Гоа в 1510 году производство соли получило огромный импульс из-за возросшего спроса на потребление.Португальская кухня требовала излишков соли, и она также использовалась для балансировки корпуса кораблей во время плавания. При господстве португальцев на море соль, произведенная в Гоа, экспортировалась даже в страны Ближнего Востока. Таким образом, соль была основным экспортным товаром « Estado da India » через порт Мормугао [6–11].

Согласно англо-португальскому договору 1878 года, британцы монополизировали добычу соли в Гоа и перепродали ее португальцам. После того, как британцы захватили солеварни, средняя квота соли на человека была снижена с 14.От 5 кг до 6,5 кг. Это заставило многих людей уменьшить потребление соли, что, в свою очередь, привело к гипонатриемии [12]. После аннексии Гоа Индией в 1961 году производство соли путем естественного испарения столкнулось с серьезным спадом, который продолжается до сих пор. Конкуренция со стороны йодированной соли, доступность соли по более низкой цене со стороны других штатов и отсутствие квалифицированной рабочей силы вынудили операторов соляных поддонов отказаться от соляных поддонов и искать другие возможности трудоустройства [13].

Площади производства соли

Гоа имеет площадь 3702 кв.км и лежит между 14 ^o 54 ^′ до 15 ^o 48 ^′ северной широты и 73 ^o 41 ^′ до 74 ^o 26 ^′ восточной долготы, с береговой линией около 110 км. Аравийское море граничит с Гоа на западе, Махараштрой на севере и Карнатакой на востоке и юге. Гоа состоит из 443 деревень с населением 1,2 миллиона человек. Бывшая союзная территория, Гоа была добавлена ​​как 25 -й штат Индийского союза 30 -го мая 1987 года.Он разделен на 2 округа, Северный Гоа и Южный Гоа, вместе состоящий из 12 талук [14]. Годовое количество осадков в Гоа составляет от 280 до 480 см, большая часть из них приходится на период с июня по октябрь. Соляные озера получают интенсивный солнечный свет и сильные ветры, что делает добычу соли в Гоа успешной только летом. Производство соли было сосредоточено в 36 деревнях, в основном в четырех талуках Пернем, Бардез, Тисвади и Салсете. Эти села расположены в устьях рек Терехол, Чапора, Бага, Мандови, Зуари и Сал (рис. 1 и 2).В настоящее время количество сел, производящих соль, резко сократилось до 9, а общая площадь нынешнего производства соли составляет около 2 978 га [15]. Из-за ландшафта и владения землей все соляные ямы в Гоа подпадают под категорию мелкомасштабного производства, площадь которого составляет менее 4,04 га и принадлежит частному сектору. В 1876 году производство соли в Гоа составляло около 44 тыс. Тонн, а в 1961 году оно сократилось до 31 тыс. Тонн. В 2011 году общее производство соли в Гоа составляло всего 2,1 тыс. Тонн. Это очень низкий показатель по сравнению с общим объемом производства соли в Индии в 2011–2012 годах, который составлял около 22179 тыс. Тонн [16].

Рисунок 1

Карта Гоа, показывающая четыре соляных талука (Пернем, Бардез, Тисвади и Салсете) Гоа (расположенного на западном побережье Индии) и их расположение в устьях различных рек (Терекхол, Чапора, Бага, Мандови, Зуари и Сал) .

Рис. 2

Производство соли в Сиридао, расположенном в Тисвади Талука, Гоа. Осажденная соль складывается в кучу и хранится для сушки по углам поддонов кристаллизатора.

Индия является третьим по величине производителем соли после Китая и США. На момент обретения независимости ежегодное производство соли Индией составляло 1900 тыс. Тонн, что делало ее импортером из Соединенного Королевства и Аденса. Но за короткий промежуток времени Индия заполнила пробел в цепочке поставок и стала экспортером соли. Основной вклад поступает из штатов Гуджарат, Раджастан и Тамил Наду, что составляет около 90% от общего объема производства в стране [16]. Способы производства соли широко варьируются в зависимости от штата, производящего соль.Помимо морской воды, для производства соли также используются подпочвенные рассолы, озерные рассолы и залежи каменной соли [17]. Частный сектор играет важную роль в производстве соли, составляя 90,3%. Рядом с большинством соляных бассейнов расположены йодирующие установки для обогащения соли йодом и железом. Если посмотреть на ситуацию в других штатах Индии, производящих соль, производство соли в Гоа не удовлетворяет его местный спрос.

Сообщества, занимающиеся производством соли

Уникальная организационная структура под названием comunidade , возглавляемая потомком по наследству, участвует в управлении деревнями и регулировании сельскохозяйственной деятельности в Гоа.Каждая деревня составляет comunidade и имеет свои собственные правила в зависимости от местных обычаев. Это одна из старейших административных структур, которая существует уже тысячу лет и признана конституцией. В прошлом comunidade отвечал за рекультивацию заболоченных земель ( хазанов ) вдоль побережья и их пригодность для сельскохозяйственной деятельности, аквакультуры, рыбоводства и производства соли. Следовательно, вся деятельность на этих землях хазанов регулировалась comunidade , включая производство соли.Доходы, полученные от этих хазанов, земель были использованы на деятельность по развитию общины [18].

В производстве соли задействованы пять общин. Это Mithgaudas, Gauddos, Bhandaris, Agris и Agers [4, 19]. Они либо владеют солеварнями, либо работают в одном из этих сообществ. Искусство изготовления соли было изобретено предками сообщества mithgauda , известной как « шаманов » [20]. митгауда является подразделением общины гауда / говада , в основном проживающей в регионах Коргаон и Агарвада в Пернем талука.Считается, что они мигрировали из пояса конкан в Махараштре [19]. Несмотря на то, что процедура производства соли, которой придерживаются все общины, одинакова; с некоторыми незначительными изменениями, такими как сбор кристаллов соли из поддонов-кристаллизаторов. Это указывает на эволюцию процесса производства соли внутри сообщества в течение определенного периода времени. В прошлом только производство соли было единственным источником дохода для жителей этих общин. С увеличением прибыли и важности, придаваемой португальцами производству соли, многие люди, у которых были земли, доступные для морской воды, начали добычу соли.Солеварни также открывали возможности трудоустройства для рабочих-мигрантов из соседних государств. [4, 20].

Процесс производства соли

Хазан земель Гоа — мелиорированные мезогалинные сельскохозяйственные угодья в устьевых регионах. В большинстве мест эти хазанов земель окружены густой пышной мангровой растительностью. Соленость и приливный приток регулируются насыпями (дамбы / насыпи / mero ) и шлюзовыми затворами ( manos ) [21].Эти шлюзовые ворота — символы богатого культурного наследия и инженерных навыков. Хазаны описываются как контурно-управляемые, топогидроинженерные, агроэкономические и агроэкологические устойчивые производственные системы. Эти хазанов земель используются под сельское хозяйство, рыбоводство и производство соли [22, 23].

Соляные ванны (Mithache Agor или Mithagar) в Гоа проходят три фазы; а именно фаза прекращения дождей, фаза подготовки соляной ванны и фаза сбора соли [2].Эти солеварни расположены в непосредственной близости от моря или могут быть расположены в устьях реки. Во время сезона дождей соляные поддоны погружаются в дождевую воду и поэтому заброшены или используются в аквакультуре для разведения рыб, креветок и креветок [24].

а) Подготовительный этап (декабрь — январь)

Приготовление соляных ванн проводится с декабря по январь. Восстановлены предыдущие насыпи (дамбы / насыпи), которые были повреждены из-за сезона дождей. Дождевая / морская вода из соляных озер сливается с помощью мотопомп.После того, как вода будет полностью слита, начинается подготовка соляных грядок. Грядки вспахиваются, выравниваются штамповкой и / с использованием устройства под названием « saalon ». На стены насыпи сгребают лишнюю глину. Saalon имеет длинную бамбуковую палку длиной примерно 4 м, прикрепленную к круглой деревянной основе. Во время этого процесса из глины лепятся и бордюры разных кастрюль.

Солеварня состоит из трех отдельных кастрюль; поддоны резервуара ( тапованим, / тапунни, ), поддоны испарителя ( podshing ) и поддоны кристаллизатора ( pikechem agor ) [25].Все сковороды соединяются между собой через отверстия по углам. Поддон резервуара используется для приема морской воды во время приливных притоков и подсоединяется ко многим поддонам испарителя. Кастрюли кристаллизатора, в свою очередь, питаются от поддонов испарителя. Размеры поддона резервуара 18–20 × 10–12 м, поддона испарителя 18–20 × 6–8 м. В некоторых соляных поддонах поддон резервуара может быть такого же размера, как поддон испарителя; однако основное различие заключается в глубине этих двух кастрюль. Поддоны резервуара имеют размер около 20 дюймов.глубина, поддерживая уровень морской воды на глубине до 15–18 дюймов, в то время как глубина поддонов испарителя составляет 10 дюймов, при этом вода заполняется на глубину до 5 дюймов. Поддон резервуара в два или три раза больше поддона кристаллизатора. Размеры поддона кристаллизатора 6,5–8 × 4–5 м, а глубина такая же, как и поддона испарителя. Уровень рассола в поддоне кристаллизатора поддерживается на максимальном уровне 3 дюйма. Размер поддонов испарителя играет решающую роль в производстве соли. Чем больше размер поддона испарителя, тем лучше производство соли (личное сообщение) .

Поддон резервуара соединен с ручьем или каналами, снабжающими морскую воду, во время приливных притоков через шлюз ( Manos ). Шлюз сделан из дерева, а ворота — из глины, смешанной с сеном. Это помогает регулировать поток воды во время муссонных дождей и приливных колебаний. Это помогает в контролируемом выпуске морской воды в поддон резервуара во время прилива и предотвращает обратный поток воды во время отлива, тем самым поддерживая уровень воды в поддоне резервуара.В этих лотках происходит рост водорослей, которые регулярно собирают и используют в качестве удобрений для плантаций кокоса и кешью. Резервуары также используются для рыбоводства, особенно для разведения соленых рыб, в период с октября по декабрь [26].

Когда соленость морской воды в поддонах резервуара становится около 5ºBé, она сбрасывается в первый поддон испарителя. Карбонат кальция (CaCO ₃ ) начинает осаждаться при солености около 5ºBé [27] в поддоне резервуара и полностью осаждается в поддоне первого испарителя.Как только рассол достигает солености около 13–15ºBé, он выходит из первого поддона испарителя во второй поддон испарителя. Во втором поддоне испарителя сульфат кальция (CaSO ₄ ) кристаллизуется в виде гипса. Эти осадки образуют твердую корку на дне поддонов испарителя. Рассол, имеющий теперь соленость около 23-25ºBé, выпускается из второго поддона испарителя в поддон кристаллизатора. Хлорид натрия (NaCl) кристаллизуется около 27ºBé, сначала в виде хлопьев, которые плавают на поверхности ( sai ), а затем оседают на дне поддона (рис. 3).Рассол в поддоне кристаллизатора вспенивается из-за кристаллизации соли. Рабочие контролируют соленость каждой кастрюли, пробуя рассол.

Рис. 3

Схема типичного солнечного солярия Гоа. → Указывает на движение рассола. ▲ Кучи кристаллов сырой соли.

Во время подготовительной фазы морской воде в испарителе и поддоне кристаллизатора дают отстояться и перемешивать снова и снова в течение примерно 20-25 дней с использованием зубчатого инструмента под названием « danto ». Danto имеет длинную палку длиной примерно 4 м, прикрепленную к инструменту с зубцами, похожими на выступы [27]. Поданной воде дают полностью испариться, и сковороды снова загружаются. Это делается для того, чтобы удалить лишнюю глину, которая, в свою очередь, будет накапливаться на стенках кастрюли, таким образом дополнительно устанавливая грядки для соли. Расположение большинства соляриев показано на рисунке 3, однако в зависимости от общей площади соляриев меньшие солярии могут не иметь отдельных испарительных поддонов.

После того, как слои установлены, свежий рассол выпускается из резервуара в поддон испарителя и, наконец, в поддон кристаллизатора для кристаллизации соли. Для кристаллизации соли при первом сборе урожая требуется до 10 дней. Некоторая неочищенная соль (приблизительно 50–60 кг) разбрызгивается на поддоны кристаллизатора для облегчения кристаллизации соли. Это повторяется два-три раза. Когда соль кристаллизуется, ее оставляют на сковороде неубранной в течение первых трех-четырех раз. Это делается для укрепления грядок и придания им однородности для дальнейшего сбора урожая.Первая собранная соль содержит много примесей, в основном взвешенных частиц глины, и имеет цвет от коричневого до серого [4, 25].

b) Фаза сбора соли (с февраля по май)

Когда солеварни полностью подготовлены, начинается пик сезона сбора соли, обычно с середины февраля и длится до конца мая или начала июня, в зависимости от сезона дождей.

Рассол из поддона испарителя, имеющий соленость 23–25 ºBé, подается в поддон кристаллизатора каждое утро. NaCl выкристаллизовывается при температуре около 27ºBé в кристаллизаторе и собирается вечером ежедневно.Кристаллы соли собирают деревянными граблями ‘foyem’ (длинная палка длиной примерно 4 м, прикрепленная к деревянному прямоугольному блоку размером 50–70 × 15–20 см) и складывают небольшими кучками на перекрестке. кастрюль [2]. В Pernem taluka кристаллы соли скапливаются в центре насыпей. Если рассол хранится дольше, соли магния и калия будут выпадать в осадок, делая соль горькой и непригодной для употребления. В таких ситуациях весь рассол сливается в канализацию, и процесс запускается заново.Как только хлорид натрия выпадает в осадок, оставшийся солевой раствор, богатый магнием и калием (выпь / маточный раствор), сливается в каналы (личное сообщение) (дополнительный файл 1: Рисунок S1).

Собранную соль дополнительно промывают концентрированным солевым раствором для удаления примесей, если таковые имеются, и дают стечь с насыпей. Затем его переносят с бамбуковыми корзинами в большую кучу с соляных кастрюль, а затем переносят на склад. Произведенная соль доставляется на местный рынок в автофургонах.

Соль, производимая в Гоа, бывает двух сортов: (i) сорт удобрения и (ii) сорт консерванта / потребления. Собранная вначале (в течение месяца) соль будет пригодна для удобрений из-за примесей грязи и глины. Он в основном используется в качестве навоза или в качестве почвенного кондиционера и репеллента от термитов для кокосовых пальм. Эту соль также используют для соления или консервирования вяленой рыбы. Соль, полученная после тонкого отверждения слоя, является белой солью потребительской категории. Его используют в качестве рассола для маринования сырых манго и в кулинарии.Соль, производимая в разных регионах, может придавать неповторимый вкус из-за текстуры почвы [25, 26, 28, 29].

Исследования биоразнообразия солнечных солончаков

Солнечные солончаки — это экстремальные условия окружающей среды, которые служат нишей для организмов, которые процветают в диапазоне экстремальной солености, температуры, pH, концентрации питательных веществ, доступности кислорода, активности воды и солнечной радиации. Микроорганизмы, которые выживают при такой высокой солености, известны как галофильные экстремофилы, к которым относятся бактерии, археи и грибы.Солнечные солянки — это искусственные экосистемы, демонстрирующие разнообразие микробных популяций на разных стадиях кристаллизации солей [30–34]. Эти микроорганизмы играют жизненно важную роль в переработке материалов (питательных и других веществ) в экосистеме солеварни и, следовательно, являются важными участниками биогеохимических циклов [35, 36]. Поскольку устьевые районы расположены в непосредственной близости от густонаселенных территорий, они подвергаются загрязнению в результате антропогенной деятельности. Кроме того, баржи, перевозящие минеральные руды, загрязняют реки и устьевые районы сырой нефтью и тяжелыми металлами.Вследствие этого рассол концентрируется вместе с металлами [37–41]. Исследования разнообразия бактерий показали присутствие представителей родов Aeromonas , Pseudomonas , Vibrio , Desulfobacter , Desulfovibrio , Desulfococcus и Chromohalobacter . Эти бактерии играют важную роль в круговороте веществ в экосистеме солеварни [35, 36, 42, 43]. Исследования культурозависимого разнообразия галоархей в солончаках Гоа показали, что Halococcus sp. являются доминирующим членом галоархей в менее засоленных условиях. На этапе сбора соли были идентифицированы представители родов Halococcus , Halorubrum , Haloarcula и Haloferax [2]. Независимые от культур исследования показали присутствие новых членов архей, принадлежащих к типу Crenarchaeota и Euryarchaeota в различных соляных озерах Гоа [44]. В грибных сообществах солончаков Гоа преобладали представители родов Aspergillus и Penicillium , такие как Aspergillus versicolor, A.wentii, A. Candidus, A. penicilloides, A. flavus, A. sydowii, Penicillium chrysogenum, P. corylophilum, P. griseofulvum, Eurotium amstelodami и Hortaea werneckii [45].

Чтобы любая экосистема была успешной, необходимо регулировать транспортировку энергии через пищевую сеть. Водоросли выступают в качестве единственного производителя в соляных поддонах, вырабатывая энергию, улавливая солнечный свет. Они служат пищей для ракообразных, таких как Artemia sp. , для кормления птиц [46]. Доминирующими компонентами сообщества фитопланктона в соляных бассейнах Гоа были представители Cyanophyceae , Chlorophyceae , Bacillariophyceae и Dinophyceae .Различные виды и их распространение показали сильную корреляцию с изменением солености. В соляных лотках обнаружены особи водорослей, принадлежащие Pediastrum sp., Oedogonium sp., Cladophora sp., Tetraselmis sp., Spirulina sp. и Spirogyra sp. Dichotomosiphon salina и Enteromorpha flexuosa . Нитчатые водоросли, такие как Oscillatoria sp. и Phormidium sp. и диатомеи, такие как Pleurosigma sp., Navicula sp., Chaetoceros sp., Amphora sp., Coscinodiscus sp., Surirella sp. и Nitzschia sp. были обычными для всех поддонов в менее засоленных условиях, но рост Dunaliella sp. оказались доминирующими с увеличением солености. Более 90% микрозоопланктона в солончаках составляют инфузории: Fabrea salina, Brachionus sp. , Тинтинниды, Индомизис sp.и Artemia sp. F. salina наблюдались в период с декабря по май, но отсутствовали в сезон дождей. Было обнаружено, что разнообразие микрозоопланктона и богатство видов в Гоанских солончаках оставляет желать лучшего [47–52]. Соляные ванны представляют собой особую экосистему, которая зависит не только от солености, но и от температуры. Это позволяет выращивать только несколько адаптированных организмов, которые могут выжить в экстремальных условиях окружающей среды.

Поскольку большая часть соляных бассейнов Гоа находится в устьевых регионах, растения, типичные для мангровых зарослей, преобладают в прилегающих районах [53].Растительность, окружающая соляные поддоны и граничащая с ручьями рядами по 4–8, — это Rhizophora mucronata и Avicennia officinalis . Немногочисленные деревья Bruguiera gymnorrhiza , Sonneratia acida , Kandelia rheedei , Excoecaria agallocha также присутствуют вместе с кустарниками Acanthus ilicifolius и Bruguiera parviflora . Среди этих видов R. mucronata и S. acida показали толерантность к засолению до 30ºBé [54].Эти растения обеспечивают дополнительное укрепление насыпей, предотвращая наводнения в сезон дождей.

Солеварни не служат местом гнездования птиц из-за постоянных неудобств со стороны человека. Однако густые пышные мангровые заросли служат приютом для многих местных и перелетных птиц. Однако соляные поддоны являются отличными кормовыми угодьями из-за наличия планктонов, таких как Artemia sp. [55]. Помимо креветок, рыбы могут привлечь большое количество рыбоядных птиц.Птицы любят индийский баклан Phalacrocorax fuscicollis , кулик болотный Tringa stagnatilis , Little Stint Calidris minuta , Jungle Myna Acridotheres fuscus , зуки, такие как Charadrius dubius , Charadrius indicus , Charadrius dubius , Charadrius indicus , Charadrius indicus , Цапли, такие как Casmerodius albus , Egretta garzetta , Egretta gularis и серая цапля Ardea cinerea , регулярно встречаются на соляных поддонах и питаются в основном ракообразными и рыбами в соляных поддонах и вокруг них.Поскольку Гоа расположен на пролетном пути Центральной Азии и Индии, соляные отмели являются привлекательным источником пищи для перелетных птиц. Птицы, похожие на шилохвостую утку Anas acuta , северную лопату Anas clypeata , аисты, похожие на Anastomus oscitans , Ciconia episcopus и Leptoptilos javanicus , красноножки Tringa tetanus , кулики, похожие на кулики, как у куликов Tringa tetanus , куликов. , Limicola falcinellus , Xenus cinereus зимой были обнаружены в регионах, окружающих соляные ванны.Летом отмечены птицы: коричневые чайки Larus brunnicephalus и крачки вида Gelochelidon nilotica , Sterna acuticauda и Chlidonias hybrida [56, 57]. Соляные ванны — это мелкие водоемы, позволяющие птицам питаться бентическими сообществами и тем самым регулируя рост донных беспозвоночных. Таким образом, солеварни отлично демонстрируют поток энергии через пищевую сеть.

Глобальные метаболические реакции на солевой стресс у пятнадцати видов

Abstract

Клетки постоянно приспосабливаются к непредсказуемым изменениям внеклеточной концентрации растворенных веществ.Краеугольным камнем реакции клеток на осмотический стресс является метаболическое снабжение энергией и строительные блоки для создания соответствующей защиты. Тем не менее, степень воздействия осмотического стресса на метаболическую сеть остается в значительной степени неизвестной. Более того, в основном неясно, какие из метаболических ответов на осмотический стресс, если таковые имеются, сохраняются у различных организмов или ограничиваются определенными группами видов. Здесь мы исследуем глобальные метаболические реакции двенадцати бактерий, двух дрожжей и двух линий клеток человека, подвергшихся устойчивому гиперосмотическому солевому стрессу, путем измерения полуколичественных уровней сотен клеточных метаболитов с использованием ненаправленной метаболомики.Помимо накопления осмопротекторов, мы наблюдали значительные изменения многих метаболитов у всех видов. Глобальные метаболические реакции были преимущественно видоспецифичными, однако индивидуальные метаболиты были подвержены определенному влиянию в зависимости от таксономии вида, естественной среды обитания, структуры оболочки или толерантности к соли. Используя широту нашего набора данных, корреляция индивидуальных величин ответа метаболитов у всех видов привела к более низкому гликолизу, циклу трикарбоновых кислот, метаболизму аминокислот с разветвленной цепью и биосинтезу гема, которые в целом важны для толерантности к соли.Таким образом, наши результаты помещают глобальную метаболическую реакцию на солевой стресс в филогенетический контекст и дают представление о клеточном фенотипе, связанном с солевой толерантностью.

Образец цитирования: Севин Д.К., Стэлин Ю.Н., Поллак Г.Р., Кюне А., Зауэр У. (2016) Глобальные метаболические реакции на солевой стресс у пятнадцати видов. PLoS ONE 11 (2):
e0148888.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888

Редактор: Хайтао Ши, Хайнаньский университет, КИТАЙ

Поступила: 16 декабря 2015 г .; Одобрена: 25 января 2016 г .; Опубликован: 5 февраля 2016 г.

Авторские права: © 2016 Sévin et al.Это статья в открытом доступе, распространяемая в соответствии с условиями лицензии Creative Commons Attribution License, которая разрешает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии указания автора и источника.

Доступность данных: Все соответствующие данные находятся в документе и его файлах с вспомогательной информацией.

Финансирование: Эта работа финансировалась проектом MetaNetX Швейцарской инициативы по системной биологии (SystemsX.ch; http: // www.metanetx.org/) оценивается Швейцарским национальным научным фондом и Федеральным правительством Швейцарии через Федеральное управление образования и науки. Финансирующие организации не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и анализе данных, принятии решения о публикации или подготовке рукописи.

Конкурирующие интересы: Авторы заявили, что никаких конкурирующих интересов не существует.

Введение

Предотвращение лизиса и поддержание гомеостаза внутриклеточной концентрации растворенных веществ в условиях непредсказуемо изменяющейся окружающей среды является серьезной проблемой для всех клеток.Поскольку цитоплазматические мембраны проницаемы для молекул воды, но ограничивают диффузию более крупных и полярных соединений, изменения внеклеточных концентраций непроницаемых растворенных веществ вызывают изменения в разнице гидростатического (тургорного) давления между цитоплазмой и окружающей средой [1]. Когда внеклеточные растворенные вещества внезапно истощаются, молекулы воды проникают в клетку и тем самым повышают ее тургорное давление. В результате механическая деформация в конечном итоге разрывает клеточную оболочку, что приводит к лизису клеток.И наоборот, накопление внеклеточных растворенных веществ заставляет молекулы воды покидать клетку, тем самым снижая ее тургорное давление и внутриклеточную активность воды. Это изменяет термодинамические свойства цитоплазмы, вызывает неправильную укладку белков и приводит к скоплению макромолекул, тем самым влияя на скорость различных клеточных процессов, начиная от связывания белок-ДНК и заканчивая метаболическими реакциями [2-6]. Поэтому поддержание тургорного давления и активности воды в физиологически приемлемом диапазоне имеет решающее значение для выживания и процветания клеток в средах с изменяющейся осмоляльностью.

Различные развитые стратегии позволяют клеткам справляться с осмотическим стрессом. Большинство микроорганизмов окружают свою хрупкую цитоплазматическую мембрану жесткой клеточной стенкой, чтобы увеличить диапазон допустимого тургорного давления при понижении осмотического давления [7]. Повышение тургорного давления само по себе ограничено конститутивно выраженными механочувствительными каналами в цитоплазматической мембране, которые неспецифически выделяют внутриклеточные растворенные вещества, когда напряжение мембраны превышает критические значения [8]. Кроме того, осмотический стресс может вызывать изменения свойств цитоплазматической мембраны, таких как проницаемость или стабильность, например, из-за накопления кардиолипина или изопреноидов [9,10].Более того, клетки способны активно регулировать осмоляльность своей цитоплазмы, регулируя внутриклеточную концентрацию растворенных веществ. После осмотического повышения неорганические ионы, такие как K ⁺ , и органические противоионы, такие как глутамат, быстро накапливаются в цитоплазме [11,12]. Когда неорганические ионы достигают токсичного уровня, они выводятся через специальные транспортеры [13,14]. Наконец, многие клетки способны продуцировать или импортировать так называемые совместимые растворенные вещества, которые могут накапливаться до высоких внутриклеточных концентраций без серьезного воздействия на клеточные процессы [15–17].Помимо балансировки внутриклеточной осмоляльности, некоторые совместимые растворенные вещества способствуют стабилизации белков [18,19] и взаимодействуют с липидами цитоплазматической мембраны [20,21].

Способность накапливать совместимые растворенные вещества сохраняется во всех царствах жизни [16] и подчеркивает ключевую роль метаболизма в клеточной осморегуляции. С химической точки зрения наиболее известные совместимые растворенные вещества представляют собой полигидроксилированные соединения, такие как сахара или полиолы (например, маннит, трегалоза), аминокислоты (например, пролин, глутамин), N-ацетилированные диаминокислоты (например,г. N _δ -ацетил-орнитин, N _ε -ацетил-лизин), эктоины (например, эктоин, β-гидроксиэктоин), бетаины (например, глицин бетаин, β-аланин бетаин) или тетины (например, диметилсульфониопропионат) свойства полярности, высокой растворимости в воде и отсутствия чистого заряда при физиологическом pH [22,23]. Использование определенных совместимых растворенных веществ, таких как глицин бетаин, является консервативным, тогда как другие соединения, по-видимому, используются только несколькими родственными видами, например β-аминокислоты и производные у метаногенных архей [16,22].Накопление и поддержание больших внутриклеточных совместимых пулов растворенных веществ представляет собой крупное вложение клеточных ресурсов с точки зрения углерода и энергии. Следовательно, изменение маршрута метаболического потока через реакции образования осмолита, как ожидается, будет мешать другим метаболическим процессам, от которых отвлекаются эти ресурсы. Более того, высокая внеклеточная осмоляльность влияет на метаболизм дополнительными способами, например, через прямое ингибирование определенных метаболических ферментов неорганическими солями [24–26] или через плейотропные эффекты, связанные со снижением скорости роста [27,28].Тем не менее, по сравнению с ролью совместимых растворенных веществ, эти глобальные метаболические реакции остаются плохо изученными и были исследованы только у нескольких видов [10,29–32]. Кроме того, остается в значительной степени неясным, коррелирует ли метаболический фенотип вида с его способностью переносить определенные уровни осмотического стресса — актуальный вопрос, имеющий значение для биомедицинских и биотехнологических исследований.

Здесь мы определили глобальные метаболические реакции пятнадцати филогенетически далеких видов с широким спектром толерантности к устойчивому гиперосмотическому солевому стрессу.Используя нецелевую масс-спектрометрию [33], мы измерили полуколичественные уровни сотен метаболитов, которые обеспечивают детальное понимание метаболических адаптаций, вызванных солевым стрессом. Мы обнаружили, что глобальные метаболические реакции являются преимущественно видоспецифичными, но отдельные метаболиты демонстрируют характерно сходные ответы у филогенетически близкородственных организмов. Наконец, мы демонстрируем, что реакции промежуточных продуктов определенных метаболических путей, включая центральный углеродный метаболизм и биосинтез гема, постоянно коррелируют с толерантностью к соли, и обсуждаем, как эти пути могут быть связаны с толерантностью к соли.

Результаты

Виды значительно различаются по солеустойчивости

Четырнадцать различных видов про- и эукариотических микробов (восемь грамотрицательных бактерий, три грамположительных бактерии, одна кислотоустойчивая бактерия и два дрожжевых грибка) были отобраны на основе их статуса модельных организмов и их общего использования в промышленности, что обеспечило широкое практическое применение. и академическая значимость наших результатов. Выбранные бактерии включают грамотрицательную модельную бактерию Escherichia coli , грамположительную модельную бактерию Bacillus subtilis , обычно используемую в качестве обычно считающегося безопасным промышленным производственным организмом, грамотрицательную бактерию Zymomonas mobilis , которая эффективно преобразует возобновляемые источники сырья в биотопливо, такое как этанол, а также грамположительные кислотоустойчивые бактерии Mycobacterium smegmatis , непатогенные и экспериментально поддающиеся лечению заместители возбудителя туберкулеза M . туберкулез . Помимо модельных дрожжей Saccharomyces cerevisiae , которые также широко используются в качестве производственных организмов в промышленности и пищевой промышленности, мы также выбрали делящиеся дрожжи Schizosaccharomyces pombe , которые обычно используются для изучения фундаментальных аспектов симметричного деления эукариотических клеток. Кроме того, мы выбрали две клеточные линии человека (первичные дермальные фибробласты и иммортализованные клетки аденокарциномы молочной железы) для оценки ответов в здоровых и злокачественных клетках млекопитающих (рис. 1А и таблица S1).

Рис. 1. Анализ солеустойчивости пятнадцати различных видов.

(A) Филогенетическое дерево анализируемых видов. Расстояния Джукса-Кантора между бактериями приведены в масштабе на основе выровненных последовательностей 16S малой рибосомной субъединицы РНК. Расстояния между эукариотами не масштабированы для визуализации. Организмы окрашены в соответствии с таксономической классификацией, указаны прочность клеточных стенок и типичные среды обитания. Дополнительная информация о штаммах и клеточных линиях представлена ​​в таблице S1.(B) Устойчивая гиперосмотическая толерантность к соли, основанная на экспериментах по ингибированию роста. Солеустойчивость выражается как среднее значение и стандартное отклонение (n = 2) концентраций, подавляющих скорость роста на 10% (IC ₁₀ ), 25% (IC ₂₅ ) и 50% (IC ₅₀ ) по сравнению с условиями без стресса. . Виды сгруппированы в соответствии с таксономической классификацией, а цветные горизонтальные полосы указывают среднее значение IC ₅₀ для каждой таксономической группы. (C) Сравнение солеустойчивости между видами, населяющими разные среды обитания.(D) Сравнение солеустойчивости между видами с разной прочностью клеточных стенок. Различия между группами на панелях от B до D не были статистически значимыми (P> 0,05, непарные двусторонние тесты t ) для всех сравнений, за исключением сравнений с линиями клеток человека.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.g001

Для количественной оценки солеустойчивости видов мы провели анализы ингибирования роста. Из построенных кривых доза-ответ (S1 рис.) Мы определили концентрации соли, ингибирующие скорость роста на 10% (IC ₁₀ ), 25% (IC ₂₅ ) или 50% (IC ₅₀ ) по сравнению с не ингибирующими. условия (рис. 1B и таблица S2).Наблюдаемые солевые толерантности значительно варьировались: значения IC ₅₀ варьировались от 150 мМ в клеточной линии MCF7 человека до 1500 мМ NaCl в Z . мобилис . Таксономическая классификация организмов не коррелировала с толерантностью к соли (рис. 1B), за исключением двух линий клеток человека, которые были особенно чувствительны, предположительно потому, что осмоляльность в тканях человеческого тела обычно жестко регулируется [34]. Естественные среды обитания микробов также не повлияли на их солеустойчивость (рис. 1С).Хотя микробы, ассоциированные с животными, были немного более толерантными, чем свободноживущие или ассоциированные с растениями, эффект не был статистически значимым (P ≥ 0,05, непарные двусторонние тесты t ). Микробы с толстыми клеточными стенками были в среднем немного более устойчивыми, чем виды с тонкими стенками, но эта разница снова не была статистически значимой (P ≥ 0,05, непарные двусторонние тесты t ; Рис. 1D), что согласуется с основным роль клеточной стенки в предотвращении лизиса клеток при гипоосмотическом стрессе.Наблюдение, что ни таксономическая классификация, ни естественная среда обитания, ни структура клеточной оболочки не были достаточными для объяснения гиперосмотической устойчивости к солевому стрессу, указывает на то, что лежащие в основе молекулярные механизмы более глубоко укоренены в клеточной физиологии.

Измерение реакции метаболома на гиперосмотический солевой стресс

Чтобы получить более глубокое представление о физиологической адаптации к устойчивому гиперосмотическому солевому стрессу, мы измерили внутриклеточные уровни метаболитов. Чтобы обеспечить сопоставимую воспринимаемую тяжесть стресса, несмотря на значительные различия в солеустойчивости, мы подвергали каждый вид воздействию концентрации соли, замедляющей скорость их роста на 0% (контроль), 10% (низкий стресс), 25% (умеренный стресс) или 50% ( высокий стресс) (таблица S2) и собранные культуры во время экспоненциального роста при оптической плотности при 600 нм, равной 1.0 (микробы) или при 50% конфлюэнтности (линии клеток человека). Внутриклеточные метаболиты экстрагировали сначала полярным, а затем неполярным растворителем для улавливания как гидрофильных, так и гидрофобных соединений, а экстракты отдельно анализировали с использованием нецелевой масс-спектрометрии с времяпролетной инжекцией [33]. После обработки и объединения спектральных данных было обнаружено 17 727 различных деталей (ионов) m / z . Для каждого организма мы извлекли связанные с видами метаболиты из базы данных Киотской энциклопедии генов и геномов (KEGG) [35], чтобы аннотировать ионы на основе точной массы.Для метаболитов с логарифмическим коэффициентом распределения октанол / вода (logP _{O / W} ) ≤ 0 использовались данные полярных экстрактов, а для метаболитов с logP _{O / W} > 0 — данные неполярных экстрактов. В зависимости от вида мы обнаружили от 662 до 1248 потенциальных метаболитов (данные S1) с присущим методу ограничением — невозможностью различать изобарические соединения. Этот широкий охват метаболомов позволяет детально изучить глобальные метаболические реакции на гиперосмотический солевой стресс.

Известные относительные уровни осмопротекторов и их накопление в результате стресса

Для систематической оценки использования известных совместимых растворенных веществ и других осмопротекторов у всех видов мы проанализировали ответы 54 обнаруженных метаболитов с подтвержденной осмопротекторной активностью, перечисленных в базе данных DEOP [36], путем вычисления кратных изменений относительно нестрессовых контрольных условий. В то время как литературные данные предполагают, что для каждого вида используется только несколько совместимых растворенных веществ (таблица S1), мы обычно наблюдали сложную структуру из десятков потенциально накапливающихся осмопротекторов (рис. 2A).Подчеркнем, что наша аналитическая платформа позволяет определять только относительные уровни метаболитов, но не их абсолютные концентрации. Следовательно, возможно, что некоторые из обнаруженных осмопротекторов достигают недостаточных абсолютных концентраций, чтобы сами по себе оказывать существенное влияние на осмотолерантность. Тем не менее, кумулятивные эффекты большого количества наблюдаемых осмопротекторов, вероятно, будут вносить, по крайней мере, частичный вклад в осмотолерантность, тем самым дополняя и модулируя эффекты установленных основных совместимых растворенных веществ.Например, в E . coli мы не только наблюдали накопление известных совместимых растворенных веществ трегалозы и глутамата [37,38] и мембраностабилизирующего изопреноида убихинона-8 [10], но также увеличивали уровни других осмопротекторов, таких как гипотаурин, аргинин, малат или N -ацетилорнитин. Аналогично C . glutamicum накапливает не только пролин, но и другие аминокислоты и производные, включая N-ацетиласпартат, N-ацетилорнитин, N, N-диметилглицин или глицин.Другие примеры включают накопление дисахаридов и N-ацетиласпартата в R . sphaeroides или гипотаурин и глицерин в P . по сравнению с . Наконец, клеточная линия MCF7 человека также накапливала различные аминокислоты и эктоин в дополнение к известным совместимым растворенным веществам инозитолу, бетаину, таурину и сорбиту.

Рис. 2. Реакция известных осмопротекторов на устойчивый гиперосмотический солевой стресс.

(A) Кратковременные изменения относительно ненапряженных контрольных условий 54 обнаруженных метаболитов с подтвержденной осмопротекторной активностью, перечисленных в базе данных DEOP [36], а также дополнительных соответствующих полипренилхинонов.Для каждого вида только осмопротекторы, показавшие значительный отклик (| log ₂ кратное изменение | ≥ 1, P <0,05, скорректированные по результатам множественного тестирования двусторонние непарные t -тесты), по крайней мере, на одну интенсивность стресса. считается. Повторяющиеся названия представляют разные ионы одного и того же метаболита, поскольку точная аннотация массы была неоднозначной; см. данные S1 для полных аннотаций. Осмопротекторы были сгруппированы по их основным химическим характеристикам. (B) Базовое содержание осмопротекторов при IC ₀ (ненапряженное контрольное состояние).Данные представлены в виде Z-баллов для сравнения относительной численности между видами. Маленькие Z-значения (| Z | <1) не окрашиваются.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.g002

Некоторые осмопротекторы накапливались у нескольких видов, тогда как другие оказались видоспецифичными, в частности, в двух линиях клеток человека. Например, аминокислоты треонин, пролин, лизин, лейцин и гистидин в основном уменьшились у микробов, но увеличились в линии клеток MCF7.Точно так же накопление моносахаридов и родственных соединений, таких как гексозы, инозит или сорбитол, также в основном наблюдалось в линиях клеток человека. Более того, грамотрицательные протеобактерии были единственной группой видов, у которых было обнаружено, что они накапливают полипренилхиноны, гидрофобные соединения, предположительно повышающие стабильность цитоплазматической мембраны [10,39], предполагая, что стабилизация мембраны в основном важна для бактерий с тонкими клеточными стенками. Напротив, более широко использовались другие осмопротекторы.Мы заметили, что они включают много простых азот- или серосодержащих соединений, таких как мочевина, гипотаурин или глицин, которые могут быть относительно легко синтезированы либо de novo , либо из предшественников в культуральной среде, не требуя экспрессии ферментов, принадлежащих сложным путям. Бетаин, совместимое растворенное вещество, которое, как известно, используется видами всех сфер жизни [16], не входило в число этих обычно накапливающих осмопротекторов, по-видимому, потому, что многие виды полагаются на его импорт из внеклеточной среды, которая в нашем случае не содержала бетаин. или его предшественник холин в достаточных количествах.

В принципе, осмотолерантность также может быть достигнута за счет естественных высоких уровней внутриклеточного осмопротектора. Чтобы сравнить базальное содержание 54 известных осмопротекторов между видами, мы рассчитали Z-баллы этих соединений в ненапряженных контрольных условиях (рис. 2В). Действительно, мы наблюдали, что у некоторых видов был высокий уровень определенных осмопротекторов даже в отсутствие солевого стресса. Например, R . sphaeroides имеет относительно высокие уровни полипренилхинонов, что указывает на особую важность стабилизации мембран в этом организме независимо от приложенного стресса, что действительно является одной из причин, по которой этот организм считается подходящим хозяином для продукции убихинона-10 [40].Аналогичным образом высокие уровни полиолов сорбита и маннита в Z . mobilis и несколько аминокислот и производных в P . fluorescens указал, что эти соединения передают этим видам пассивную базальную осмозащиту. Наиболее поразительными были относительно высокие уровни большого количества различных осмопротекторов, включая полиолы, аминокислоты и окислительно-восстановительные соединения глутатион, дисульфид глутатиона и дегидроаскорбат в дрожжах S . cerevisiae . Таким образом, наши данные показывают, что в S . cerevisiae , помимо хорошо известного накопления глицерина, естественные высокие уровни осмопротекторов и соединений, снимающих стресс, дополнительно способствуют устойчивости к солевому стрессу, что согласуется с предыдущими исследованиями, показавшими, что в S . cerevisiae абсолютные уровни известных осмопротекторов составляли 80–90% покрытого метаболома [41,42] по сравнению с 70% в E . coli [43] (S2 рис). Таким образом, поддержание в целом высоких уровней осмопротекторов может быть дополнительной стратегией к индуцированному солевым стрессом накоплению совместимого растворенного вещества, которое потребует меньшего дополнительного синтеза белка, меньших метаболических перестроек и менее сложной регуляции.

Глобальные реакции метаболического солевого стресса преимущественно видоспецифичны

Чтобы исследовать глобальные метаболические реакции на гиперосмотический солевой стресс более глубоко, помимо накопления осмопротекторов, мы определили кратные изменения всех обнаруженных ионов метаболитов относительно условия изосмотического контроля (данные S1).В анализе основных компонентов виды не разделялись на отдельные кластеры (рис. 3A и 3B), что указывает на то, что глобальные метаболические реакции не определялись конкретными межвидовыми отношениями. Число дифференциальных метаболитов, снова определяемое как имеющее | log ₂ -кратное изменение | ≥ 1 и значение P <0,05 (непарные двусторонние тесты t , исправленные множественные тесты) по крайней мере для одной интенсивности солевого стресса значительно различались между видами (рис. 3C). В среднем было затронуто 133 метаболита, максимум — 50 и 223 метаболита в Z . mobilis и P . против соответственно. Как и ожидалось, количество дифференциальных метаболитов увеличивалось с увеличением концентрации соли у всех видов, подтверждая, что более высокий клеточный стресс отражался в метаболоме, предположительно в основном через плейотропные эффекты, вызванные снижением скорости роста или изменениями в размере клеток. У большинства видов большинство дифференциальных метаболитов было истощено, возможно, потому, что стрессированные клетки тратили больше ресурсов на осмозащиту за счет других биосинтетических задач.Сложные ответы были в значительной степени видоспецифичными, потому что большинство метаболитов были затронуты только у одного или двух видов (рис. 3D).

Рис. 3. Гиперосмотический солевой стресс вызывает сложные и преимущественно видоспецифичные глобальные метаболические реакции.

(A) Анализ главных компонентов (PCA) был проведен на основе логарифма ₂ кратных изменений ионов метаболита при низком (IC ₁₀ , L), среднем (IC ₂₅ , M) или высоком (IC ₅₀₎ , H) солевой стресс относительно ненапряженного контроля.Для каждого вида три точки интенсивности напряжения соединены треугольными участками для визуализации. Патчи и метки окрашены в соответствии с таксономической классификацией, как показано на рисунке 1A. (B) График загрузки метаболитов, лежащих в основе PCA, показан на панели A. Выбранные метаболиты с большими коэффициентами выделены. Обратите внимание, что аннотации метаболитов основаны на точной массе и могут быть неоднозначными; см. данные S1 для полных аннотаций. (C) Количество сильно и значимо реагирующих метаболитов в каждом анализируемом виде, сгруппированных либо по самой низкой интенсивности стресса, при которой наблюдались изменения (серые столбцы), либо по направлению изменения (пурпурные и синие столбцы).(D) Гистограмма количества видов, у которых ионы метаболитов были затронуты индивидуальной интенсивностью солевого стресса (черные, темно-серые и светло-серые кривые) или по крайней мере одной интенсивностью стресса (пурпурная кривая).

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.g003

Чтобы проверить, отражают ли различия между метаболическими ответами филогенетические отношения анализируемых видов, мы построили кладограмму на основе определенных кратных изменений метаболитов (рис. 4A). .Обнадеживает то, что образцы трех уровней интенсивности солевого стресса сгруппированы вместе для всех видов, кроме одного, демонстрируя, что метаболические реакции на разную интенсивность стресса внутри вида были более похожи друг на друга, чем на реакции разных организмов. Интересно, что кладограмма не напоминала филогенетическое дерево (сравните с рис. 1А), за исключением двух дрожжей, двух линий клеток человека и двух фирмикутов, каждая из которых сгруппировалась вместе. Например, две актинобактерии были отделены друг от друга, как и пять протеобактерий.Основное различие заключалось в отсутствии четкого разделения про- и эукариот, что является признаком филогении. Чтобы подтвердить это наблюдение, мы систематически коррелировали все попарные расстояния метаболической реакции с филогенетическими расстояниями между анализируемыми видами (рис. 4B). Действительно, хотя корреляции были положительными и статистически значимыми при более высоких интенсивностях стресса (P = 0,062 для IC ₁₀ , P = 0,031 для IC ₂₅ и P = 0,002 для IC ₅₀ , модифицированных тестов Стьюдента t ), они были слабыми (R Пирсона между 0.17 и 0.28), подтверждая, что филогенетические отношения не были основным определяющим фактором метаболической реакции на солевой стресс. Точно так же ни естественная среда обитания, ни структура клеточной оболочки, ни солеустойчивость этого вида не могут объяснить глобальный метаболический ответ (S3, рис.).

Рис. 4. Филогенетических взаимоотношений между видами недостаточно для объяснения различий в ответах на метаболический солевой стресс.

(A) Кладограмма анализируемых видов на основе логарифма ионов метаболитов ₂ кратных изменений при воздействии низкой (IC ₁₀ , L), средней (IC ₂₅ , M) и высокой (IC ₅₀ , H) солевой стресс по сравнению с контролем без стресса (IC ₀ ).Попарные расстояния между образцами рассчитывались с использованием метрики Cityblock. Метки видов окрашены в соответствии с таксономической классификацией, как показано на рис. 1A. (B) Корреляция попарных расстояний между видами на основе реакции метаболического солевого стресса с филогенетическими расстояниями. Расстояния между метаболическими ответами на разную степень солевого стресса были рассчитаны на основании логарифма ₂ -кратных изменений ионов метаболита относительно IC ₀ с использованием показателя Cityblock и филогенетических расстояний на основе выровненных последовательностей РНК малых рибосомных субъединиц с использованием метода Джукса-Кантора. мера.R указывает коэффициент корреляции Пирсона.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.g004

Чтобы проверить, влияют ли филогения или другие факторы на подмножества изменений метаболома, мы систематически сравниваем ответы отдельных метаболитов с помощью четырехфакторного дисперсионного анализа ( ANOVA). Действительно, мы обнаружили 137 метаболитов, которые были способны сильно и значительно (средний логарифм ₂ -кратное изменение в наиболее отдельной группе> 1, значение P ANOVA <0.01) объясняют различия между группами хотя бы по одному фактору. Для 97 из этих метаболитов дисперсия зависела от таксономической группы (рис. 5А). Например, две линии клеток человека специфически накапливали гексозы, которые не наблюдались ни у одного из микробов, что согласуется с ранее сообщенным накоплением инозита в почечных клетках человека [17]. Другой специфической для человека реакцией было истощение β-цитрил-L-глутамата, хелатирующего железо соединения, которое, как недавно было показано, поддерживает митохондриальное окислительное фосфорилирование, предотвращая инактивацию аконитазы при окислительном стрессе [44], что может объяснить наблюдаемую гексозу. накопление путем блокирования потока цикла трикарбоновых кислот.Другими примерами зависящих от таксономии ответов метаболитов являются накопление цитозина Actinobacteria , Firmicutes и γ-Proteobacteria , а также γ-Proteobacteria -специфическое истощение предшественника липополисахарида АДФ-L-глицеро-β. -D-манно-гептоза, демонстрируя, что филогенетические отношения между видами действительно влияют на метаболическую реакцию на солевой стресс, хотя и только на уровне отдельных метаболитов. Аналогичным образом, 77 и 73 значительно отличающиеся метаболиты наблюдались при рассмотрении естественной среды обитания или структуры клеточной стенки (рис. 5B и 5C), например истощение предшественника клеточной стенки UDP-N-ацетилмурамоил-L-аланин-D-глутамата у животных: ассоциированные бактерии или накопление убихинона-8 и его предшественника 3-октапренил-4-гидроксибензоата в тонкостенных грамотрицательных бактериях.Хотя эти факторы, очевидно, частично взаимозависимы с таксономией, наши данные тем не менее предполагают, что естественная среда обитания и структура клеточной стенки могут вносить вклад в реакцию конкретных метаболитов на солевой стресс.

Рис. 5. Ответы на отдельные метаболиты зависят от таксономии видов, среды обитания, толщины клеточной стенки и солеустойчивости.

Четырехфакторный дисперсионный анализ (ANOVA) был выполнен на log ₂ кратных изменений метаболитов у разных видов при высоком солевом стрессе (IC ₅₀ ).Показаны средние и стандартные ошибки 40 наиболее значимых метаболитов каждого фактора (все с ANOVA P <0,01 и | log ₂ -кратное изменение |> 1 по крайней мере в одной группе). Метаболиты отсортированы слева направо по возрастанию значения P . (A) Группировка видов согласно таксономической классификации. (B) Группировка по среде обитания. (C) Группировка по толщине стенки ячейки. (D) Группировка в соответствии с толерантностью к соли (IC ₅₀ <500 мМ NaCl = низкий; 500 ≤ IC ₅₀ ≤ 1000 мМ = средний; IC ₅₀ > 1000 мМ = высокий).Обратите внимание, что аннотации метаболитов основаны на точной массе и могут быть неоднозначными; см. данные S1 для полных аннотаций.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.g005

Последним и, возможно, наиболее интригующим фактором, который мы рассмотрели, была устойчивость к соли, которая, как мы обнаружили, в значительной степени не зависит от таксономической классификации, естественной среды обитания или клеточной стенки. структура (рис. 1B). Действительно, мы наблюдали 43 существенно разных метаболита среди видов с разным уровнем солеустойчивости (рис. 5D).Большинство из этих характерных метаболитов специфически истощается у солеустойчивых видов, в то время как только некоторые из них накапливаются, что согласуется с нашим предыдущим анализом, который показал, что накопление индивидуальных осмопротекторов не зависит от солеустойчивости (рис. 2А). Одной большой группой метаболитов, которые постоянно истощались у солеустойчивых видов, были различные аминокислоты, включая лейцин, триптофан или метионин, подразумевая, что солеустойчивые виды могут либо снижать свой биосинтез, чтобы перенаправить свои ресурсы на стрессовые реакции, либо, наоборот, использовать эти соединения в качестве предшественники для других процессов, участвующих в осмозащите, таких как синтез осмопротекторов, как мы обсудим ниже.Вторую группу метаболитов составляли различные тиоэфиры КоА и сам КоА, которые также более сильно истощались у солеустойчивых видов. Истощение CoA и производных ранее наблюдалось у подвергнутого солевому стрессу E . coli [10,45], но его функциональная роль неясна, в частности, поскольку было обнаружено, что более высокие уровни КоА фактически улучшают солевую толерантность растений за счет изменения липидного обмена [46]. Таким образом, хотя глобальные метаболические реакции были в основном видоспецифичными, реакция отдельных метаболитов неизменно зависела от филогении, среды обитания, структуры клеточной стенки и солеустойчивости.

Ответы нескольких метаболитов и метаболических путей коррелируют с солевой толерантностью

На данный момент мы идентифицировали метаболиты, потенциально связанные с солеустойчивостью, на основании их специфических реакций у солеустойчивых и солеочувствительных видов. Тем не менее, солеустойчивость — это не отдельный фенотип, а, скорее, постоянное свойство, на которое влияет взаимодействие различных клеточных факторов и факторов окружающей среды, что, вероятно, объясняет различные метаболические реакции, которые мы наблюдали даже среди сравнительно толерантных клеток.Таким образом, мы провели корреляционный анализ, чтобы идентифицировать метаболиты, реакция которых постепенно увеличивалась или уменьшалась с увеличением значений IC ₅₀ анализируемых видов (рис. 6A и данные S2). В общей сложности ответы 36 антикоррелированных метаболитов (R <-0,5) и 25 метаболитов хорошо коррелировали (R> 0,5) с солеустойчивостью и, кроме того, показали абсолютный логарифм ₂ -кратное изменение> 1 по крайней мере у 25% видов. , что указывает на стабильно сильную реакцию на солевой стресс.Среди антикоррелирующих метаболитов были аминокислоты с разветвленной цепью валин, лейцин и изолейцин, ароматические аминокислоты фенилаланин и триптофан, серосодержащая аминокислота метионин, различные тиоэфиры КоА и сам КоА, а также несколько промежуточных продуктов биосинтеза гема. Среди коррелирующих метаболитов было значительное количество соединений центрального углеродного метаболизма, включая пируват и 2-оксоглутарат.

Рис. 6. Корреляционный анализ ответов метаболитов с солеустойчивостью.

(A) Корреляция кратных изменений метаболитов в ответ на сильный солевой стресс со значениями IC ₅₀ для различных организмов была оценена с помощью коэффициента корреляции Пирсона R. Для каждого метаболита верхний квартиль x _0,75 абсолютного логарифма ₂ -кратных изменений для всех видов были нанесены на график против R. Учитывались только метаболиты, обнаруженные более чем у 10 видов. Метаболиты с | R | > 0,5 и x _0,75 > 1 выделены синим (антикоррелирующие метаболиты) и розовым цветом (коррелирующие метаболиты), а также перечислены названия типичных соединений.Полные данные корреляции представлены в S2 Data. (B) Визуализация метаболитов, коррелирующих с толерантностью к соли на карте метаболических путей KEGG с использованием PathwayProjector [47]. Интенсивность цвета метаболитов указывает на силу положительной (розовый) или отрицательной (синий) корреляции, а размер указывает x _0,75 . Ключевые пути выделены и помечены. (C) Корреляция кратности изменения с солеустойчивостью для выбранных соединений при низком гликолизе; (D) в метаболизме цистеина и метионина; (E) в метаболизме аминокислот с разветвленной цепью; и (F) в биосинтезе гема.На панелях от C до F показаны среднее значение и стандартное отклонение для четырех (микробы) или трех (линии клеток человека) повторов. Обратите внимание, что аннотации метаболитов основаны на точной массе и могут быть неоднозначными; см. данные S1 для полных аннотаций.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.g006

Чтобы получить систематический обзор путей, в которых участвовали эти коррелирующие метаболиты, мы визуализировали их на карте глобального метаболического пути KEGG с помощью PathwayProjector (рис. 6B) [ 47].В то время как некоторые коррелирующие метаболиты были, по-видимому, отключены от соседних соединений, многие другие сгруппировались по каноническим путям. Поразительно, что ответы практически всех промежуточных продуктов низшего гликолитического пути и многих соединений цикла трикарбоновых кислот и пентозофосфатного пути показали положительную корреляцию с солеустойчивостью (рис. 6С). Хотя наши данные не устанавливают какой-либо причинно-следственной связи, этот результат согласуется с гипотезой об увеличении производства энергии и регенерации окислительно-восстановительного кофактора у солеустойчивых видов, что потенциально позволяет этим видам выделять больше энергии и строительных блоков для биосинтеза осмопротекторов или для смягчить побочные побочные эффекты, например, за счет более эффективного удаления активных форм кислорода (АФК) с помощью НАДФН-зависимых ферментов, таких как глутатионредуктаза [48].Более того, мы наблюдали положительную корреляцию нескольких промежуточных продуктов в биосинтезе метионина и цистеина (рис. 6D), последний содержит активную составляющую и является прямым предшественником хорошо известного глутатиона, поглотителя АФК. Аналогичным образом, уровни поздних промежуточных продуктов и конечных продуктов лейцина, изолейцина и валина в метаболизме аминокислот с разветвленной цепью снижались сильнее у солеустойчивых организмов (рис. 6E). Потенциальная роль этого сильного истощения может заключаться в том, что аминокислоты с разветвленной цепью используются в качестве доноров аммония в реакциях трансаминирования с 2-оксоглутаратом для производства более высоких клеточных уровней основных осмозащитных аминокислот глутамата и пролина.Этот путь, ведущий к накоплению осмолита, действительно наблюдался у бактерии Rhizobium meliloti , у которой экзогенное добавление лейцина стимулировало биосинтез глутамата при осмотическом стрессе [49], а также у растений, у которых засуха индуцировала экспрессию аминокислот с разветвленной цепью. трансферазы [50,51]. Наши данные предполагают, что этот механизм широко консервативен и количественно связан с солеустойчивостью. Мы не наблюдали сильного накопления самого глутамата у большинства видов, но, поскольку внутриклеточные уровни глутамата в нестрессированных клетках обычно значительно выше, чем у других аминокислот, этого не обязательно ожидать.Наконец, мы выделяем биосинтез гема, промежуточные соединения которого сильно антикоррелированы с солеустойчивостью. (Рис. 6F). Гем — это широко консервативный хелатирующий железо циклический тетрапиррол, который представляет собой простетическую группу белков, участвующих в дыхательной цепи переноса электронов и во многих других клеточных процессах [52], и ниже мы обсуждаем несколько гипотез, как истощение гема может быть связано с толерантностью к соли.

Обсуждение

В этой работе мы использовали нецелевую метаболомику для исследования глобальных метаболических ответов двенадцати различных бактерий, двух дрожжей и двух линий клеток человека, подвергшихся гиперосмотическому солевому стрессу.Мы заметили, что у всех организмов солевой стресс влияет на изобилие десятков метаболитов во всех их метаболических сетях, но, что удивительно, большинство метаболитов реагируют только у одного или двух видов. Этот глобальный метаболический ответ с высокой видовой специфичностью поначалу кажется неожиданным, поскольку повсеместное возникновение солевого стресса предполагает, что он должен был встречаться уже на ранних этапах жизни, и поэтому можно было ожидать более консервативного ответа. Тем не менее, хорошо известно, что солеустойчивость сама по себе иногда может значительно различаться даже среди видов одного и того же рода [53], как и использование совместимых растворенных веществ [22,54].Более того, виды, принадлежащие к одним и тем же таксономическим группам, часто имеют принципиально разные метаболические фенотипы и образ жизни и, следовательно, вероятно, у них развились механизмы реакции, приспособленные к их конкретным потребностям. В этом свете наши наблюдения подтверждают мнение о том, что филогения не является основным определяющим фактором того, как клетки реагируют на солевой стресс.

Какие еще факторы могут объяснить эти различные метаболические реакции? Очевидная гипотеза, которую мы проверили, заключалась в том, что аналогичные уровни солеустойчивости совпадают с аналогичными изменениями в метаболизме.Тем не менее, мы не нашли доказательств того, что наблюдаемые глобальные метаболические реакции зависели от того, сколько соли отдельные виды были способны переносить. Одна из возможностей состоит в том, что виды с более высокой солеустойчивостью имеют более высокие базальные уровни осмопротекторов уже в стрессовых условиях, фенотип, который мы действительно наблюдали в нашем исследовании для некоторых солеустойчивых организмов, в частности S . cerevisiae . Вторая возможность возникает из-за различий в регуляции метаболизма между разными видами, а это означает, что степень перекрестного взаимодействия между путями реакции на солевой стресс и другими клеточными процессами, вероятно, будет различаться.Третья возможность заключается в том, что на определенные ферменты по-разному влияет соль, что приводит к видоспецифическим ответам метаболитов в их метаболическом окружении. Кроме того, мы рассмотрели роль естественной среды обитания анализируемых организмов, поскольку тяжесть и частота переживаемого солевого стресса, доступность осмопротекторов, а также совместное возникновение других возмущений и стимулов, вероятно, будут формировать глобальную метаболическую реакцию на солевой стресс в результате эволюции. выбор.Однако наш анализ не предоставил доказательств того, что в определенных средах обитания организмы могут проявлять определенные метаболические реакции заранее. Одна из возможных причин заключается в том, что применяемые нами определения местообитаний были довольно грубыми и что исследованные виды в пределах отдельных местообитаний были очень разнообразными, а это означает, что нашему набору данных может не хватать статистической мощности, необходимой для выявления потенциальных ассоциаций, которые можно было бы решить в будущем с помощью более глубокий охват видов, населяющих подобные места обитания.Другая причина может заключаться в том, что мы решили выращивать все виды в одинаковых экспериментальных условиях, тем самым потенциально маскируя естественное влияние окружающей среды. Тем не менее, отделение окружающей среды от метаболических эффектов, вызываемых солью, было бы трудным и, вероятно, неубедительным, по крайней мере, для различных отобранных видов.

Беспрецедентный анализ, который стал возможным благодаря нашему глобальному метаболомическому подходу, заключался в корреляции величин ответа отдельных метаболитов и метаболических путей с солеустойчивостью анализируемых видов.В то время как ответы промежуточных продуктов пути были слишком слабыми, чтобы быть статистически значимыми у отдельных видов сами по себе, корреляция величины ответа с толерантностью к соли у широкого круга видов действительно предполагает, что влияние этих путей на метаболический ответ на осмотический стресс законсервировано. Среди путей с устойчивой корреляцией множества промежуточных соединений были центральный углеродный метаболизм и выработка энергии, метаболизм аминокислот с разветвленной цепью и биосинтез гема.Более активный центральный углеродный метаболизм может обеспечить солеустойчивые организмы необходимой энергией и строительными блоками для подпитки процессов, обеспечивающих солеустойчивость, таких как биосинтез совместимых растворенных веществ. Кроме того, пониженные уровни аминокислот с разветвленной цепью могут указывать на их повышенное потребление в реакциях трансаминирования, подпитывающих накопление осмопротекторного глутамата.

Наконец, мы предлагаем три не исключающие друг друга гипотезы, как истощение промежуточных продуктов биосинтеза гема может быть связано с солеустойчивостью.Во-первых, отметим, что у большинства видов коммитируемыми стадиями биосинтеза гема являются реакции, превращающие глутамат через глутамил-тРНК ^{, Glu} и полуальдегид глутамата в 5-аминолевулинат [52]. Накопление глутамата в качестве осмопротектора может потребовать от клеток снижения утилизации глутамата за счет конкурирующих процессов, таких как биосинтез гема, и организмы, делающие это более тщательно, смогут поддерживать более высокие внутриклеточные концентрации глутамата. Вторая возможность возникает из ранее сообщенной связи между гомеостазом железа и осмотическим стрессом у галофильной бактерии Chromohalobacter salexigens , которая, как было обнаружено, активно снижает потребность в железе и его усвоение при воздействии высоких концентраций соли [55].Внутриклеточное железо катализирует расщепление перекиси водорода на гидроксильные и гидропероксильные радикалы в реакции Фентона, основного источника АФК и окислительного повреждения клеток [56], и, следовательно, более низкие уровни железа, связанного с гемом, могут снизить окислительный стресс, который может быть следствием осмотического стресса [56]. 57,58]. Таким образом, причиной того, что некоторые виды переносят более высокие концентрации соли, может быть то, что они накапливают меньше АФК. Третья и последняя гипотеза состоит в том, что биосинтез гема снижается, потому что этот путь является дорогостоящим, поскольку он включает до десяти различных ферментов и множество сложных кофакторов, включая пиридоксаль-5’-фосфат, тРНК, флавины и S-аденозил-L-метионин [52].Следовательно, виды, которые сильнее снижают количество копий ферментов, участвующих в биосинтезе гема, будут иметь больше ресурсов для осмозащиты. Тем не менее, основываясь на наших данных, мы не можем различить, действительно ли регуляция транскрипции или трансляции была ответственна за зависимое от соли изменение уровней предшественников гема, или были ли задействованы другие регуляторные механизмы, не влияющие на уровни белка, такие как посттрансляционная регуляция, и это будет интересно. чтобы проверить эти гипотезы в будущих исследованиях.

Насколько нам известно, набор данных, который мы получили, до сих пор является наиболее полным сборником индуцированных солевым стрессом метаболических реакций среди группы таких разнообразных видов. Следовательно, наши данные позволяют с беспрецедентной глубины созерцать не только канонические реакции, такие как накопление совместимых растворенных веществ [38], но также и множество других метаболических изменений, которые могут отражать сложные функциональные связи между различными клеточными процессами. Хотя выявление механизмов, лежащих в основе или вызывающих эти сложные реакции, является сложной задачей и явно выходит за рамки данной работы, мы выше обсудили несколько случаев, в которых наши данные, по-видимому, подтверждают и расширяют ранее описанные механизмы.Мы прогнозируем, что обогащение и дополнение будущего анализа клеточной реакции на солевой стресс, возможно, управляемое вычислительными моделями или интеграцией ортогональных данных [59], может стать основным приложением созданного нами ресурса. Более того, разнообразие проанализированных видов предполагает, что этот ресурс потенциально актуален для различных сообществ, от биотехнологических до биомедицинских исследований. В целом, наше исследование дало подробное представление о ключевой роли метаболизма в клеточных реакциях различных организмов на гиперосмотический солевой стресс, а также позволило взглянуть на эволюционные и экологические детерминанты солеустойчивости.

Материалы и методы

Штаммы и клеточные линии

Штаммы и клеточные линии, использованные в этой работе, и соответствующие ссылки перечислены в таблице S1. Линии клеток человека были созданы ранее и коммерчески доступны (линия клеток HDF от Cell Applications Inc., Сан-Диего, Калифорния, США, номер в каталоге 106-05n; линия клеток MCF7 от DSMZ, Брауншвейг, Германия, номер в каталоге ACC115).

Химические вещества

Все химические вещества были закуплены у Sigma Aldrich (St.Луис, Миссури, США) с наивысшей доступной чистотой (обычно> 95%), если не указано иное.

Среда для культур бактериальных клеток

Среда, используемая для культур бактериальных клеток, представляла собой лизогенный бульон (LB; 10 г / л бакто-триптона, 5 г / л экстракта бакто-дрожжей, 5 г / л D-глюкозы) с добавлением NaCl, как указано.

Среда для культур дрожжевых клеток

Среда, используемая для культур дрожжевых клеток, представляла собой среду YPD (10 г / л экстракта дрожжей Bacto, 20 г / л пептона Bacto, 20 г / л D-глюкозы) с добавлением NaCl, как указано.

Культуры клеток человека

Клетки HDF культивировали при 37 ° C и 5% CO. ₂ в увлажненной атмосфере в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM; Life Technologies) с добавлением 4,5 г / л D-глюкозы, 2 мМ GlutaMAX, 10% фетальной телячьей сыворотки ( PAA, Pasching, Austria), 100 Ед / мл пенициллин / стрептомицин и указанные количества NaCl и использовали в пассажах с четвертого по шестой. Клетки MCF7 культивировали в идентичных условиях в среде DMEM с добавлением питательной смеси F-12 (Life Technologies), 4.5 г / л D-глюкозы, 2 мМ GlutaMAX, 10% фетальной бычьей сыворотки, 100 Ед / мл пенициллина / стрептомицина и указанные количества NaCl. Клетки поддерживали разделением дважды в неделю в соотношении 1: 6 при приблизительно 80% конфлюэнтности путем добавления фосфатно-солевого буфера (PBS; Life Technologies), содержащего 0,25% трипсина, в течение 2 минут после промывания предварительно нагретым PBS.

Анализ солеустойчивости бактериальных клеток

Предварительные культуры в 5 мл среды LB с добавлением 5 г / л NaCl инокулировали из глицериновых растворов при -80 ° C и инкубировали при 30 ° C в орбитальном шейкере при 300 об.вечера. на 24 ч. Из этих предварительных культур 5 мкл использовали для инокуляции прозрачных 96-луночных планшетов с плоским дном, содержащих 200 мкл предварительно нагретой среды LB на лунку, дополненную двенадцатью различными концентрациями NaCl от 50 мМ до 2500 мМ в дубликатах. Рост клеток культур, встряхиваемых при 30 ° C, контролировали на приборе для чтения планшетов TECAN Infinite M200 (группа TECAN) путем измерения оптической плотности при 600 нм каждые 10 минут в течение периода не менее 24 часов. По полученным кривым роста были рассчитаны максимальные экспоненциальные скорости роста, и значения IC ₁₀ , IC ₂₅ и IC ₅₀ были рассчитаны из сигмоидальных кривых, подогнанных к максимальным скоростям роста, нанесенным на график в зависимости от концентрации соли (S1 Рис.).

Анализ солеустойчивости дрожжей

Анализ солеустойчивости дрожжей выполняли аналогично анализу на бактериях, за исключением того, что в качестве среды использовалась среда YPD, используемые 96-луночные планшеты были прозрачными плоскими цветочными планшетами (лаборатория M2P), а рост при 30 ° C контролировали путем измерения культуры мутность с 5-минутными интервалами в течение периода не менее 48 часов с использованием BioLector (M2P labs) при относительной влажности окружающей среды, установленной на уровне 85%.

Анализ солеустойчивости клеточных линий человека

клеток HDF и MCF7 собирали при 80% конфлюэнтности и высевали при плотности 10 000 клеток / лунку в 96-луночные планшеты, содержащие соответствующие среды с добавлением от 0 до 250 мМ NaCl в шести повторах на концентрацию.Число клеток определяли через 24 ч, 48 ч и 72 ч путем промывания PBS, фиксации в течение 15 минут 4% параформальдегидом и окрашивания ядер 1 мкг / мл Hoechst 33342, растворенного в PBS. Интенсивность флуоресценции Hoechst на лунку (длина волны возбуждения 350 нм, длина волны излучения 460 нм), линейно коррелирующая с числом клеток, что подтверждено серией разведений (S4 фиг.), Измеряли на планшет-ридере TECAN Infinite M200 (группа TECAN) для количественной оценки роста клеток. Количество клеток через 72 часа наносили на график в зависимости от концентрации соли, и значения IC ₁₀ , IC ₂₅ и IC ₅₀ вычисляли из сигмоидального соответствия этим данным (S1 фиг.).

Пробоподготовка для метаболомики

Микробы выращивали в 1,5 мл соответствующей среды в 96-луночных планшетах при 30 ° C, встряхивая со скоростью 300 об / мин. при указанных концентрациях соли в четырех повторностях до достижения оптической плотности 1,0 при 600 нм. Затем собирали культуру объемом 1 мл путем быстрого центрифугирования (1 мин при 13000 g и 4 ° C) и гасили жидким азотом до дальнейшей обработки. Метаболиты из клеточных гранул сначала экстрагировали в течение 10 минут при 85 ° C 150 мкл этанола: воды (70: 30% по объему) для захвата полярных соединений.После центрифугирования (10 мин при 13000 g и 4 ° C) и сбора супернатанта проводили вторую экстракцию 150 мкл хлороформ: метанол (2: 1% по объему) в течение 1 ч при 4 ° C для улавливания неполярных соединения, такие как липиды. Линии клеток человека выращивали в 6-луночных чашках для культивирования, как описано выше, в присутствии указанных концентраций NaCl в трех экземплярах до достижения 50% конфлюэнтности. Затем клетки дважды быстро промывали 75 мМ карбонатом аммония при pH 7,4 и погружали в жидкий азот для прекращения метаболизма.Метаболиты сначала дважды экстрагировали в течение 2 минут при 85 ° C с помощью 700 мкл этанола: воды (70: 30% об. / Об.) И после сбора супернатанта один раз в течение 1 ч при 4 ° C с помощью 1,5 мл хлороформа: метанола ( 2: 1% -в / об). Перед анализом образцы хранили при -80 ° C не более двух недель.

Масс-спектрометрия с впрыском потока

Образцы метаболизма были проанализированы с помощью времяпролетной МС с инжекцией потока [33] с помощью прибора Agilent 6550 iFunnel QToF (Agilent, Санта-Клара, Калифорния, США), работающего в режиме отрицательной ионизации с высоким разрешением 4 ГГц в диапазоне от 50–1000 m / z с использованием опубликованных настроек.Все образцы были проанализированы в одной партии, чтобы минимизировать межпартийную изменчивость, и всегда анализировались две технические реплики на образец. Подвижная фаза представляла собой 60:40 изопропанол: вода (об. / Об.) И 1 мМ NH ₄ F при pH 9,0 с добавлением 10 нМ гексакис (1H-, 1H-, 3H-тетрафторпропокси) фосфазин и 80 нМ таурохолевой кислоты для онлайн-тестирования. массовая коррекция. Спектральная обработка и аннотация ионов на основе точной массы в пределах 0,005 Да с использованием для каждого вида списка метаболитов, полученных из реагентов геномно-кодируемых ферментов, на основе базы данных KEGG [35] и с учетом [MH] ^— и [MH, 1x ¹² C-> ¹³ C] ^— видов было выполнено с использованием Matlab R2015a (The Mathworks, Nattick, MA, U.S.A.), как описано ранее [33]. Метаболомические данные были нормированы квантилем для учета вариаций экстрагированной биомассы и либо log ₂ -кратных изменений нормализованной интенсивности ионов относительно ненапряженных условий, либо Z -счетов для каждого иона по всем видам (содержание иона в (вид за вычетом среднего содержания этого иона, деленного на его стандартное отклонение), как указано, для определения относительных количеств.

Статистический и вычислительный анализ

Статистический и вычислительный анализ данных был выполнен с использованием Matlab R2015a (The Mathworks) и функций, встроенных в наборы инструментов «Биоинформатика» и «Статистика».Типы используемых статистических тестов и возвращенные значения P указываются при обращении к этим тестам. Поправка на множественное тестирование применялась при указании с использованием метода оценки вероятности ложного обнаружения Стори и Тибширани [60].

Дополнительная информация

S1 Рис. Анализ ингибирования роста солью.

Экспоненциальные скорости роста микробов при устойчивом солевом стрессе определялись измерениями поглощения (бактерии) или мутности (дрожжи) в сложных средах при 30 ° C и нормализовались по соответствующим скоростям роста в условиях отсутствия стресса.Линии клеток человека культивировали при 37 ° C в течение 72 часов при указанных концентрациях соли, и подсчет клеток определяли на основе измерений флуоресценции Hoechst и нормализации к соответствующему количеству клеток в нестрессовых условиях. (А) А . tumefaciens . (В) В . subtilis . (С) С . глутамикум . (Г) Е . Коли . (E) L . казеи . (Ж) М . смегматис . (G) П . по сравнению с . (В) П . флуоресцентный . (I) П . Путида . (Дж) R . sphaeroides . (К) S . cerevisiae . (L) S . помбе . (М) S . meliloti . (Н) Z . мобилис . (O) H . sapiens HDF. (П) Н . sapiens MCF7. (Q) Легенда и метки осей для панелей A-P. n = 2 для микробов и n = 4 для линий клеток человека.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.s003

(TIF)

S2 Рис. Внутриклеточные пулы известных осмопротекторов.

(А) E . coli , выращенная в среде с минимальной глюкозой, внутриклеточные данные из [43]. (В) S . cerevisiae , выращенные в среде с минимальным содержанием глюкозы, данные по удельному весу в сухом состоянии из [42] преобразованы во внутриклеточные концентрации, предполагая, что объем цитоплазмы составляет 40 мкл, а сухой вес клеток составляет 30 пг / клетка.Только соединения, количественно определенные в обоих исследованиях, рассматриваются в панелях A и B для учета различного аналитического охвата. Эти соединения перечислены под легендой. (C) Общие внутриклеточные концентрации количественно определенных осмопротекторов в обоих исследованиях. Соединения были классифицированы как известные осмопротекторы согласно базе данных DEOP [36].

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.s004

(TIF)

S3 Рис. Естественная среда обитания, структура клеточной стенки и солеустойчивость не имеют доминирующего влияния на глобальную метаболическую реакцию на солевой стресс.

Анализ главных компонентов (PCA) был проведен на основе логарифма ₂ кратных изменений ионов метаболита при низком (IC ₁₀ , L), среднем (IC ₂₅ , M) или высоком (IC ₅₀ , H) ) солевой стресс по сравнению с контролем без стресса. Для каждого вида три точки интенсивности напряжения соединены треугольными участками для визуализации. Патчи и метки окрашены в соответствии с соответствующими обозначениями на панелях, как показано на рис. 1A. Классификация видов на основе (А) естественной среды обитания; (B) толщина стенки ячейки и (C) солевой толерантность (IC ₅₀ <500 мМ NaCl = низкий; 500 ≤ IC ₅₀ ≤ 1000 мМ = средний; IC ₅₀ > 1000 мМ = высокий).Нижележащий график нагрузки с выделенными выбранными метаболитами показан на рис. 3В.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.s005

(TIF)

S4 Рис. Количественное определение количества клеток путем окрашивания ядер по Хёхсту.

Калибровочные кривые были построены путем разбавления известного количества клеток в PBS, применения окрашивания Hoechst и измерения интенсивности флуоресценции при длинах волн 350 нм (возбуждение) и 460 нм (эмиссия). Данные представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения для шести повторов.К точкам в диапазоне ненасыщенного сигнала применялась линейная аппроксимация. (А) Н . sapiens клеток HDF. (В) Н . sapiens клеток MCF7.

https://doi.org/10.1371/journal.pone.0148888.s006

(TIF)

Благодарности

Мы благодарны Й. Ленгефельду за предоставление S . pombe , а также лабораториям Sauer и Zamboni за содержательные обсуждения.

Вклад авторов

Задумал и спроектировал эксперименты: DCS US.Проведены эксперименты: JS GRP AK. Проанализированы данные: DCS JS GRP. Написал статью: DCS US.

Список литературы

1. 1.
   Wood JM. Бактериальная осморегуляция: парадигма изучения клеточного гомеостаза. Annu Rev Microbiol. 2011; 65: 215–238. pmid: 21663439
2. 2.
   Record TM, Courtenay ES, Cayley S, Guttman HJ. Механизмы биофизической компенсации буферизации E . coli белок-нуклеиновая кислота взаимодействия при изменении окружающей среды.Trends Biochem Sci. 1998. 23: 190–194. pmid: 9612084
3. 3.
   Куртенэ Э.С., Кэпп М.В., Андерсон К.Ф., Record MT. Осмометрические исследования взаимодействий осмолит-белок под давлением пара: значение для действия осмопротекторов in vivo и для интерпретации экспериментов с «осмотическим стрессом» in vitro. Биохимия. 2000; 39: 4455–4471. pmid: 10757995
4. 4.
   Мика Дж. Т., Ван Ден Богаарт Г., Винхофф Л., Красников В., Пулман Б. Свойства молекулярного просеивания цитоплазмы Escherichia coli и последствия осмотического стресса.Mol Microbiol. 2010; 77: 200–207. pmid: 20487282
5. 5.
   Гарнер М.М., Бург МБ. Макромолекулярная скученность и ограничение в клетках, подверженных гипертонусу. Am J Physiol. 1994; 266: C877 – C892. pmid: 8178962
6. 6.
   Cayley S, Lewis BA, Record MT Jr. Происхождение осмозащитных свойств бетаина и пролина в Escherichia coli K-12. J Bacteriol. 1992; 174: 1586–1595. pmid: 1537801
7. 7.
   Silhavy TJ, Kahne D, Walker S. Оболочка бактериальной клетки.Cold Spring Harb Perspect Biol. 2010; 2: 1–16.
8. 8.
   Calamita G, Bishai WR, Preston GM, Guggino WB, Agre P. Молекулярное клонирование и характеристика AqpZ, водного канала из Escherichia coli . J Biol Chem. 1995; 270: 29063–29066. pmid: 7493926
9. 9.
   Романцов Т, Гуань З., Вуд Дж. Кардиолипин и реакция бактерий на осмотический стресс. Biochim Biophys Acta — Biomembr. Elsevier B.V .; 2009; 1788: 2092–2100.
10. 10.
    Севин Д.К., Зауэр У.Накопление убихинона улучшает устойчивость к осмотическому стрессу у Escherichia coli . Nat Chem Biol. 2014; 10: 266–272. pmid: 24509820
11. 11.
    Laimins LA, Rhoads DB, Epstein W. Осмотический контроль экспрессии оперона kdp в Escherichia coli . Proc Natl Acad Sci. 1981; 78: 464–468. pmid: 6787588
12. 12.
    Whatmore A, Reed R. Определение тургорного давления у Bacillus subtilis : возможная роль K + в регуляции тургора. J Gen Microbiol.1990; 136: 2521–2526. pmid: 2127801
13. 13.
    Balcells L, Gómez N, Casamayor A, Clotet J, Ariño J. Регулирование солеустойчивости у делящихся дрожжей с помощью протеин-фосфатазо-2-подобной протеинфосфатазы Ser / Thr. Eur J Biochem. 1997; 250: 476–483. pmid: 9428701
14. 14.
    Цзя З. П., Маккалоу Н., Мартель Р., Хеммингсен С., Янг П. Г.. Амплификация гена в локусе, кодирующем предполагаемый антипортер Na + / H +, придает толерантность к натрию и литию у делящихся дрожжей. EMBO J. 1992; 11: 1631–40.pmid: 1314171
15. 15.
    Вуд Дж. М., Бремер Э., Чонка Л. Н., Кремер Р., Пулман Б., ван дер Хайде Т. и др. Осмосенсибилизация и накопление бактериями растворенных веществ, совместимых с осморегулятором. Comp Biochem Physiol A Mol Integr Physiol. 2001; 130: 437–60. pmid: 11

7

16. 16.
    Empadinhas N, Da Costa MS. Механизмы осмоадаптации у прокариот: распределение совместимых растворенных веществ. Int Microbiol. 2008; 11: 151–161.
17. 17.
    Burg MB. Молекулярные основы осмотической регуляции.Am J Physiol. 1995; 268: F983 – F996. pmid: 7611465
18. 18.
    Палег Л.Г., Стюарт Г.Р., Старр Р. Влияние совместимых растворенных веществ на белки. Почва растений. 1985; 89: 83–94.
19. 19.
    Гекко К, Тимашев С.Н. Механизм стабилизации белков глицерином: преимущественная гидратация в смесях глицерин-вода. Биохимия. 1981; 20: 4667–4676. pmid: 7295639
20. 20.
    Pereira CS, Hünenberger PH. Влияние трегалозы на фосфолипидную мембрану при механическом воздействии.Биофиз Дж. 2008; 95: 3525–34. pmid: 18599628
21. 21.
    Орта БАК, Перич-Хасслер Л., Хюненбергер PH. Взаимодействие дисахаридов трегалозы и гентиобиозы с липидными бислоями: сравнительное исследование молекулярной динамики. Модель графа Дж. Моля. 2010; 29: 331–46. pmid: 21115286
22. 22.
    да Коста М.С., Сантос Х., Галински Е.А. Обзор роли и разнообразия совместимых растворенных веществ у бактерий и архей. Adv Biochem Eng Biotechnol. 1998. 61: 117–153. pmid: 9670799
23. 23.Кемпф Б., Бремер Э. Поглощение и синтез совместимых растворенных веществ в качестве реакции микробного стресса на среду с высокой осмоляльностью. Arch Microbiol. 1998. 170: 319–330. pmid: 9818351
24. 24.
    Мадерн Д., Эбель С., Заккаи Г. Галофильная адаптация ферментов. Экстремофилы. 2000; 4: 91–98. pmid: 10805563
25. 25.
    Гринуэй H, Осмонд CB. Солевые реакции ферментов карбоксилирования видов, различающихся по солевой толерантности. Plant Physiol. 1972: 49: 260–263. pmid: 16657937
26. 26.Флауэрс Т.Дж., Маннс Р., Колмер ТД. Токсичность хлорида натрия и клеточные основы солеустойчивости у галофитов. Энн Бот. 2015; 115: 419–431. pmid: 25466549
27. 27.
    Klumpp S, Hwa T. Бактериальный рост: глобальное влияние на экспрессию генов, обратную связь роста и разделение протеома. Curr Opin Biotechnol. Elsevier Ltd; 2014; 28: 96–102.
28. 28.
    Чубуков В., Героса Л., Кохановский К., Зауэр Ю. Координация микробного метаболизма. Nat Rev Microbiol. Издательская группа «Природа»; 2014; 12: 327–40.
29. 29.
    Берендс V, Райалл Би, Ван Икс, Банди Дж. Дж., Уильямс HD. Метаболический профиль Pseudomonas aeruginosa демонстрирует, что антисигма-фактор MucA модулирует толерантность к осмотическому стрессу. Мол Биосист. 2010; 6: 562. pmid: 20174684
30. 30.
    Коль С., Мерло М.Э., Шелтема Р.А., де Фрис М., Вонк Р.Дж., Киккерт Н.А. и др. Метаболомическая характеристика реакции на солевой стресс у Streptomyces coelicolor . Appl Environ Microbiol. 2010. 76: 2574–2581.pmid: 201

31. 31.
    Лоу Р.Г., Лорд М., Рыбак К., Тренгов Р.Д., Оливер Р.П., Соломон П.С. Метаболомный подход к изучению осмотического стресса у возбудителя пшеницы Stagonospora nodorum . Fungal Genet Biol. Elsevier Inc .; 2008. 45: 1479–1486.
32. 32.
    Чае Ю.К., Ким С.Х., Эллингер Дж.Э., Маркли Дж.Л. Эффекты дозировки соли и pH-стресса на Saccharomyces cerevisiae при мониторинге метаболитов с помощью двумерной ЯМР-спектроскопии. Bull Korean Chem Soc.2013; 34: 3602–3608. pmid: 25642011
33. 33.
    Фюрер Т., Хеер Д., Бегеманн Б., Замбони Н. Высокопроизводительное и точное профилирование массового метаболома клеточных экстрактов с помощью масс-спектрометрии времени пролета потока. Anal Chem. 2011; 83: 7074–80. pmid: 21830798
34. 34.
    Робертсон Г.Л., Шелтон Р.Л., Атар С. Осморегуляция вазопрессина. Kidney Int. 1976; 10: 25–37. pmid: 181630
35. 35.
    Канехиса М., Гото С., Сато И., Кавасима М., Фурумичи М., Танабэ М.Данные, информация, знания и принципы: назад к метаболизму в KEGG. Nucleic Acids Res. 2014; 42: D199–205. pmid: 24214961
36. 36.
    Бугуффа С., Радованович А., Эссак М., Бажич В.Б. DEOP: база данных по осмопротекторам и связанным с ними путям. База данных. 2014; 2014: bau100 – bau100. pmid: 25326239
37. 37.
    Giaever HM, Styrvold OB, Kaasen I, Strom AR. Биохимическая и генетическая характеристика синтеза осморегуляторной трегалозы у Escherichia coli .J Bacteriol. 1988; 170: 2841–2849. pmid: 3131312
38. 38.
    Запись MT Jr, Courtenay ES, Cayley DS, Guttman HJ. Отзывы E . coli к осмотическому стрессу: большие изменения количества растворенных веществ цитоплазмы и воды. Trends Biochem Sci. 1998. 23: 143–8. pmid: 9584618
39. 39.
    Эрнандес В.А., Эрикссон Е.К., Эдвардс К. Убихинон-10 изменяет механические свойства и увеличивает стабильность фосфолипидных мембран. Biochim Biophys Acta — Biomembr. Эльзевьер Б.V .; 2015;
40. 40.
    Yoshida H, Kotani Y, Ochiai K, Araki K. Производство убихинона-10 с использованием бактерий. J Gen Appl Microbiol. 1998. 44: 19–26. pmid: 12501289
41. 41.
    Кристен С., Зауэр У. Внутриклеточная характеристика аэробного метаболизма глюкозы у семи видов дрожжей с помощью анализа потока 13C и метаболомики. FEMS Yeast Res. 2011; 11: 263–272. pmid: 21205161
42. 42.
    Канелас А.Б., Тен Пиерик А., Рас С., Сейфар Р.М., Ван Дам Дж.С., Ван Гулик В.М. и др.Количественная оценка методов экстракции внутриклеточных метаболитов для метаболомики дрожжей. Anal Chem. 2009. 81: 7379–7389. pmid: 19653633
43. 43.
    Беннетт Б.Д., Кимбалл Э.Х., Гао М., Остерхаут Р., Ван Дин С.Дж., Рабиновиц Д.Д. Абсолютные концентрации метаболитов и предполагаемая занятость активного центра фермента у Escherichia coli . Nat Chem Biol. 2009; 5: 593–609. pmid: 19561621
44. 44.
    Хамада-Канадзава М., Нарахара М., Такано М., Мин К.С., Танака К., Мияке М.β-Цитрил-L-глутамат действует как носитель железа для активации аконитазной активности. Биол Фарм Булл. 2011; 34: 1455–64. pmid: 21881233
45. 45.
    Чохнан С., Идзава Х., Нишихара Х., Такамура Ю. Изменения размера внутриклеточных пулов кофермента А и его тиоэфиров в клетках Escherichia coli K-12 в зависимости от различных источников углерода и стрессов. Biosci Biotechnol Biochem. 1998; 62: 1122–8. pmid: 9692193
46. 46.
    Рубио С., Уайтхед Л., Ларсон Т.Р., Грэм И.А., Родригес П.Л.Биосинтетический фермент кофермента А фосфопантетеинаденилилтрансфераза играет решающую роль в росте растений, устойчивости к солевому / осмотическому стрессу и хранению липидов в семенах. Plant Physiol. 2008. 148: 546–556. pmid: 18621975
47. 47.
    Коно Н., Аракава К., Огава Р., Кидо Н., Осита К., Икегами К. и др. Pathway Projector: веб-браузер с возможностью масштабирования, использующий атлас KEGG и API Карт Google. PLoS One. 2009; 4: e7710. pmid: 19₄
48. 48.
    Rescigno M, Perham RN. Структура НАДФН-связывающего мотива глутатионредуктазы: эффективность определяется эволюцией.Биохимия. 1994; 33: 5721–7. pmid: 8180198
49. 49.
    Ботсфорд Дж. Л., Льюис Т. А.. Осморегуляция в Rhizobium meliloti : производство глутаминовой кислоты в ответ на осмотический стресс. Appl Environ Microbiol. 1990; 56: 488–494. pmid: 16348124
50. 50.
    Урано К., Курихара Ю., Секи М., Шинозаки К. «Омикс» анализ регуляторных сетей в ответах растений на абиотический стресс. Curr Opin Plant Biol. Elsevier Ltd; 2010. 13: 132–138.
51. 51.
    Virlouvet L, Jacquemot M-P, Gerentes D, Corti H, Bouton S, Gilard F и др.Белок ZmASR1 влияет на биосинтез аминокислот с разветвленной цепью и поддерживает урожай зерна кукурузы в условиях ограниченного количества воды. Plant Physiol. 2011; 157: 917–936. pmid: 21852416
52. 52.
    Хайнеманн И.Ю., Ян М., Ян Д. Биохимия биосинтеза гема. Arch Biochem Biophys. 2008; 474: 238–251. pmid: 18314007
53. 53.
    Ventosa A, Nieto JJ, Oren A. Биология умеренно галофильных аэробных бактерий. Microbiol Mol Biol Rev.1998; 62: 504–44. Доступно: http: // www.pubmedcentral.nih.gov/articlerender.fcgi?artid=98923&tool=pmcentrez&rendertype=abstract pmid: 9618450
54. 54.
    Empadinhas N, da Costa MS. Разнообразие, распределение и биосинтез совместимых растворенных веществ у прокариот. Contrib to Sci. 2009; 5: 95–105.
55. 55.
    Аргандона М., Ньето Дж. Дж., Иглесиас-Герра Ф., Кальдерон М. И., Гарсия-Эстепа Р., Варгас С. Взаимодействие между гомеостазом железа и реакцией на осмотический стресс в галофильной бактерии Chromohalobacter salexigens .Appl Environ Microbiol. 2010. 76: 3575–3589. pmid: 20363778
56. 56.
    Коппенол WH. 100-летие реакции Фентона. Free Radic Biol Med. 1993; 15: 645–651. pmid: 8138191
57. 57.
    Смирнова Г.В., Музыка Н.Г., Октябрьский О.Н. Роль антиоксидантных ферментов в ответе Escherichia coli на осмотическое повышение. FEMS Microbiol Lett. 2000; 186: 209–13. pmid: 10802173
58. 58.
    Калир А., Полякофф-Майбер А. Изменения активности малатдегидрогеназы, каталазы, пероксидазы и супероксиддисмутазы в листьях Halimione portulacoides (L.) Эллен подверглась воздействию высоких концентраций хлорида натрия. Энн Бот. 1981; 47: 75–85.
59. 59.
    Севин Д.